【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其涉及一种猪圆环病毒3型的重组质粒及其应用。
技术介绍
1、猪圆环病毒(porcine circovirus，pcv)是一种环状、单股负链dna病毒，属于圆环病毒科圆环病毒属。pcv3的基因组全长为2000bp，包含三个主要开放阅读框(open readingframes，orf)，分别为orf1、orf2和orf3。2016年，美国palinski等通过宏基因组学分析，从患有pnds的病死母猪和流产胎儿中首次发现pcv3。其后，美国、中国、巴西、意大利、韩国、泰国、西班牙、丹麦、德国、瑞典和波兰等许多国家都发表了大量关于检测出pcv3的报道，表明该病毒已快速在全球范围内传播。2017年3月，广东省报告了我国首例pcv3感染病例。除了在猪体中检测到pcv3外，在犬科动物和其他哺乳动物中也鉴定到pcv3的存在。cui等提出pcv3起源于蝙蝠，鸟类是蝙蝠圆环病毒传播给猪的重要中间宿主，这种传播方式增加了跨物种传播的风险，影响到公共卫生安全。进一步分析cap蛋白的氨基酸序列可知，全球流行的pcv3菌株主要分为pcv3a、pcv3b和pcv3c三种亚型，其中pcv3a的流行率正在不断上升。
2、当猪体感染pcv3后，主要损伤呼吸与消化系统，会引起肠道微生物群的动态变化，破坏了菌群的平衡，其次伴随渗出性皮炎等症状。pcv3存在垂直传播，会穿过胎盘屏障并且在胎儿的组织内复制，产生较高的病毒载量，甚至导致怀孕母猪出现死胎与木乃伊胎。pcv3持续性病毒血症的出现，增加了再次感染的可能性，虽然病毒可能在猪体内长时
3、jiang等通过应用cdna克隆技术拯救的pcv3病毒感染4和8周龄的spf猪，成功复制出了仔猪的皮炎与肾病综合征。wang等将pcv3阳性临床病料接种pk-15细胞，连续传代3次后进行细胞裂解收集病毒液，应用该病毒液感染3周龄仔猪，结果表明实验猪在感染第7天出现较高水平的特异性抗体；病原组织分布表明pcv3具有广泛的组织嗜性，且在肺脏与淋巴结中的病毒载量最高，但无肉眼可见的临床症状。deng等也将pcv3阳性临床病料接种pk-15细胞，连续传代5次后进行细胞裂解收集病毒液，以此病毒液进行实验猪感染，感染第17天可检测到病毒血症，而且血清中促炎细胞因子显著上调，多个器官均出现了病理损伤。由于无法实现pcv3病毒的细胞成功分离，上述两种pcv3野毒感染猪体方法都只能采用低代次且没有纯化的pcv3野毒开展实验，因此都不能有效排除病毒液中污染其它病原和病毒效价过低的可能，以上研究结果需通过纯化或重构的pcv3病毒进一步验证。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种猪圆环病毒3型的重组质粒，可以感染pk-15细胞并连续传代，从而实现病毒拯救。
2、本专利技术第一方面提供了一种猪圆环病毒3型的重组质粒，将序列为：seq id no.1的基因序列通过ecori和spei酶切位点克隆入pbluescript sk载体所得的重组质粒。
3、本专利技术第二方面提供了一种上述重组质粒在猪圆环病毒3型的病毒拯救中的应用。
4、本专利技术第三方面提供了一种上述重组质粒的应用，将所述重组质粒转染至pk-15细胞，进行细胞带毒传代，从而获取猪圆环病毒3型的重组病毒。
5、优选地，所述重组质粒转染至pk-15细胞的方法，包括如下步骤：
6、将pk-15细胞铺六孔细胞培养板，当细胞汇合度达到80％左右时，弃掉上清，用pbs洗三次，加入1ml无双抗无血清的dmem营养液，放到37℃，5％co2培养箱中备用；将3.5μl转染试剂与4μl质粒分别加入50μl的dmem中，孵育5min，将两者混合后，再次孵育20min，混合液加入到提前准备好的pk-15细胞中，4h后补加1ml完全营养液，继续培养24h后进行带毒连续传代。
7、本专利技术第四方面提供了一种上述重组质粒在制备免疫制剂的应用。
8、本专利技术的有益效果：
9、本专利技术的重组质粒转染pk-15细胞后可以获得成功拯救的pcv3重组病毒并能进行连续传代，同时重组pcv3病毒和阳性pcv3病料的pcv3野毒生物学特性相同，接种细胞后都不能在pk-15细胞内增殖，重组pcv3病毒的构建成功为开展猪体感染实验和后续开发疫苗提供了不可或缺的生物材料，突破了猪体感染实验和疫苗等免疫制剂开发的瓶颈。
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1.一种猪圆环病毒3型的重组质粒，其特征在于，将序列为：SEQ ID No.1的基因序列通过EcoRI和SpeI酶切位点克隆入pBluescript SK载体所得的重组质粒。
2.一种如权利要求1所述的重组质粒在猪圆环病毒3型病毒拯救中的应用。
3.如权利要求1所述的重组质粒的应用，其特征在于，将所述重组质粒转染至PK-15细胞，进行细胞带毒传代，从而获取具有感染活性的猪圆环病毒3型重组病毒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述重组质粒转染至PK-15细胞的方法，包括如下步骤：
5.如权利要求1所述的重组质粒在制备免疫制剂的应用。
【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒3型的重组质粒，其特征在于，将序列为：seq id no.1的基因序列通过ecori和spei酶切位点克隆入pbluescript sk载体所得的重组质粒。
2.一种如权利要求1所述的重组质粒在猪圆环病毒3型病毒拯救中的应用。
3.如权利要求1所述的重组质...
【专利技术属性】
技术研发人员：李玉峰，张宝戈，蔡金双，缪芬芳，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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