【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及水痘减毒活疫苗的。
技术介绍
1、水痘是一种常见传染病，高发于儿童，传染性较强。水痘疫苗是一种减毒的活的病毒疫苗，即水痘减毒活疫苗，其经水痘病毒传代毒株制备而成，是预防水痘感染的唯一手段，接种水痘疫苗不仅能预防水痘，还能预防因水痘-带状疱疹而引起的并发症。
2、现有技术中常见的水痘减毒活疫苗的制备方法多为直接感染法，如通过体积百分含量大于12%的牛血清mem生长液进行人胚胎肺二倍体细胞培养，其后直接在生长液得到的培养细胞中接种oka株病毒，其后再经较复杂的细胞培养液去除、人胚肺二倍体细胞消化等过程得到病毒收获物。
3、以上方法通常具有以下缺陷：病毒收获过程繁琐、费时费力，导致制备中病毒失活原液的质量明显降低，同时，所得水痘减毒活疫苗中容易出现牛血清白蛋白残留量高的问题。
技术实现思路
1、针对现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提出一种新的水痘减毒活疫苗的制备方法及所得水痘减毒活疫苗，该制备方法可通过低牛血清含量的细胞培养液、病毒培养液及超声处理简捷、高效地获得质量稳定且优异的水痘减毒活疫苗，同时，制备中所用毒种量少，原料消耗少，所得疫苗中牛血清白蛋白及其他杂质含量低。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种新型水痘减毒活疫苗的制备方法，其包括：
4、（1）在37±1℃下，采用细胞生长液对mrc-5株人胚肺二倍体细胞进行连续传代培养；
5、（2）待细胞培养扩增至38代后，将所述细胞生长液更换为病
6、（3）确认细胞病变面积达到10~30%后，弃去所述病毒培养液，按照200~300ml/层细胞工厂加入pbs溶液润洗2~3次，其后按照150~250ml/层细胞工厂的液量加入病毒维持液，于35℃±1℃继续培养；
7、（4）当细胞病变面积达到70%以上后，弃去所述病毒维持液，加入磷酸盐缓冲液润洗1次，弃去洗液后再按照80~120ml/层细胞工厂的液量加入所述磷酸盐缓冲液，进行超声处理，超声处理后收集所得感染细胞，并进行离心处理，离心处理后弃去上清液，按照离心前总体积的5~15%的液量加入冻干稳定剂重悬沉淀物，合并混匀后，即得到病毒收获物，将其于-60℃以下冻存；
8、（5）将制备得到的冻存后病毒收获物进行复融，其后加入冻干稳定剂进行稀释合并，过滤后，得到原液；
9、（6）使用密封管道将所述原液导入半成品瓶中，得到半成品；
10、（7）将所得半成品进行分装及冻干，得到所述新型水痘减毒活疫苗；
11、其中，
12、所述细胞生长液由体积百分含量为8~10%的牛血清和体积百分含量为2~3%的3%l-谷氨酰胺溶液和余量的e`mem溶液组成，并调节ph值为7.2±0.2；
13、所述3%l-谷氨酰胺溶液含有以下组分：0.03g/ml的l-谷氨酰胺、0.0068g/ml的nacl、0.0004g/ml的kcl、0.0002g/ml的cacl2·2h2o、0.00017g/ml的mgcl2·6h2o、0.000158g/ml的nah2po4·h2o和0.0011g/ml的葡萄糖，溶剂为注射用水；
14、所述e`mem溶液为e`mem干粉的水溶液，其中e`mem干粉的含量为0.0094g/ml；
15、所述病毒培养液由体积百分含量为2~5%的牛血清和体积百分含量为2~3%的所述3%l-谷氨酰胺溶液和余量的所述e`mem溶液组成，并调节ph值为7.6±0.2；
16、所述pbs溶液含有以下组分：0.008g/ml的 nacl、0.0004g/ml的 kcl、0.00006g/ml的kh2po4、0.000132 g/ml的na2hpo4·12h2o和0.001g/ml的葡萄糖，溶剂为注射用水；
17、所述病毒维持液由体积百分含量为0.5~1.5%的人血白蛋白和体积百分含量为2~3%的所述3%l-谷氨酰胺溶液和余量的所述e`mem溶液组成，并调节ph值为7.6±0.2。
18、优选的，步骤（5）中所述稀释合并包括：向复融后的病毒收获物中加入所述冻干稳定剂的溶液，稀释至病毒滴度为5.0~5.3lg pfu/ml。
19、优选的，步骤（5）中所述过滤使用孔径为90~150μm的过滤器。
20、优选的，所述磷酸盐缓冲液含有以下组分：2.126×10-3g/ml的nacl、0.344×10-3g/ml的nah2po4·h2o和5×10-3g/ml的na2hpo4·12h2o，溶剂为注射用水。
21、优选的，所述超声处理使用细胞工厂外超声设备，超声功率为80~90%、超声频率为20000hz、气源压力为0.4~0.5mpa、超声时间为1.2~1.5s、环境温度为18~26℃。
22、优选的，所述离心处理的离心力为10000~15200×g，离心时间为15~20min。
23、优选的，所述离心处理的温度为2~8℃。
24、优选的，所述ph值的调节通过5.6%nahco3溶液实现，所述5.6%nahco3溶液为nahco3的水溶液，其中nahco3的浓度为0.056g/ml。
25、优选的，所述冻干稳定剂包括以下组分：蔗糖、海藻糖、谷氨酸钠、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠十二水合物和人血白蛋白。
26、本专利技术具备以下有益效果：
27、（1）本专利技术可通过8~10vol%牛血清的e'mem生长液进行细胞培养并得到高质量的减毒活疫苗，其使用的牛血清含量低，成品中牛血清白蛋白残留量相对于现有技术更低。
28、（2）本专利技术不需通过如edta溶液进行细胞消化的过程，而可直接通过超声处理的方式得到病毒收获物，解决了现有技术中病毒收获操作繁琐、费时费力，病毒失活原液质量降低的问题，并减少了成品中的外来杂质。
29、（3）本专利技术中毒种接种仅为0.01～0.005 m.o.i，可减少毒种用量，节省原料，提高效率，降低成本。
30、（4）本专利技术可通过加入冻干稳定剂进行稀配的方式，配制得到符合滴度要求且无批间差的水痘减毒活疫苗，提高了所得疫苗的质量稳定性。
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1.一种新型水痘减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的新型水痘减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述稀释合并包括：向复融后的病毒收获物中加入所述冻干稳定剂的溶液，稀释至病毒滴度为5.0~5.3lg PFU/ml。
3.根据权利要求1所述的新型水痘减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述过滤使用孔径为90~150μm的过滤器。
4.根据权利要求1所述的新型水痘减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液含有以下组分：2.126×10-3g/ml的NaCl、0.344×10-3g/ml的NaH2PO4·H2O和5×10-3g/ml的Na2HPO4·12H2O，溶剂为注射用水。
5.根据权利要求1所述的新型水痘减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，所述超声处理使用细胞工厂外超声设备，超声功率为80~90%、超声频率为20000Hz、气源压力为0.4~0.5Mpa，超声时间为1.2~1.5s，环境温度为18~26℃。
6.根据权利要求1所述的新型水痘减毒活疫苗的制备方
7.根据权利要求1所述的新型水痘减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，所述离心处理的温度为2~8℃。
8.根据权利要求1所述的新型水痘减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，所述pH值的调节通过5.6%NaHCO3溶液实现，所述5.6%NaHCO3溶液为NaHCO3的水溶液，其中NaHCO3的浓度为0.056g/ml。
9.根据权利要求1所述的新型水痘减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，所述冻干稳定剂包括以下组分：蔗糖、海藻糖、谷氨酸钠、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠十二水合物和人血白蛋白。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的新型水痘减毒活疫苗的制备方法制备得到的新型水痘减毒活疫苗。
...【技术特征摘要】
1.一种新型水痘减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的新型水痘减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述稀释合并包括：向复融后的病毒收获物中加入所述冻干稳定剂的溶液，稀释至病毒滴度为5.0~5.3lg pfu/ml。
3.根据权利要求1所述的新型水痘减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述过滤使用孔径为90~150μm的过滤器。
4.根据权利要求1所述的新型水痘减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液含有以下组分：2.126×10-3g/ml的nacl、0.344×10-3g/ml的nah2po4·h2o和5×10-3g/ml的na2hpo4·12h2o，溶剂为注射用水。
5.根据权利要求1所述的新型水痘减毒活疫苗的制备方法，其特征在于，所述超声处理使用细胞工厂外超声设备，超声功率为80~90%、超声频率为20000hz、气源压力为0....
【专利技术属性】
技术研发人员：梁智杰，杨旭，李占春，蒋佳丽，陈小伟，
申请(专利权)人：成都柏奥特克生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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