【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及肿瘤的生物治疗技术，研发基因表达调控以消除肿瘤干细胞性质的候选生物药物。专利技术方法制备的产物能防止肿瘤恶性增殖与转移、降低临床难治性提高治疗效率。
技术介绍
0、技术背景
1、肺癌在我国城市恶性肿瘤的发病中已高居首位，且其发病率仍呈明显上升趋势，每年增长率高达26.9％，预计到2025年中国将成为世界第一肺癌大国。小细胞肺癌的发病率约占全部肺癌患者的20％，发病人数也将达到相当数量。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％，在妇女仅次于子宫癌，已成为威胁妇女健康的主要病因。乳腺癌被发现是所有年龄段的[1]中最具侵袭性的癌症。2020年乳腺癌患病率(5年)排名第一(15.4％)，高于所有其他癌症。肿瘤干细胞(cscs)或肿瘤起始细胞(tics)具有自我更新和分化能力，可产生不同的肿瘤细胞后代。
2、肿瘤干细胞(cscs)是存在于所有亚型癌细胞的一个亚群。化疗耐药、患者生存率低。干细胞性质相关分子sox2已被确定，并被认为是多种癌症的核心多能性相关转录因子之一。我们前期的实验研究发现，mir-145-5p在骨髓间充质干细胞中表达较高，mir-145-5p能通过下调抑制sox2可以抑制癌细胞的干性、和侵袭性；sox2为干细胞相关基因，下调后，能抑制乳腺癌细胞的癌变和化疗耐药性；mir-145-5p是多种癌症的肿瘤抑制因子mirna，包括膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、胆管癌、肾癌和胃肠道癌，对临床上易转移复发且化疗抗性的肿瘤有抑制、增强治疗效果的临床应用价值。
4、mirna(microrna)可包裹在外泌体中，它们可以被邻近或远处的细胞摄取，并随后调节受体细胞。外泌体(exosome)是细胞分泌的直径为40-100nm的膜囊泡，几乎存在于所有生物液体中。大多数细胞释放到细胞外空间，其中含有蛋白质、mrna、微小rna(mirna)和其他非编码rna(ncrna)等。释放的外泌体可以被邻近细胞或远处细胞摄取，随后调节受体细胞。外泌体作为″天然纳米颗粒″可用于药物输送载体，其制药潜力被越来越多的研究开发所关注。它们具有低细胞毒性、最大化药物生物利用度，以及出色的靶向归巢特异性等。有越来越多的临床试验开始探索外泌体的治疗效果。因此，肿瘤来源的外泌体可用作无细胞治疗载体，以浸润肿瘤微环境(tme)进行树突状细胞的激活。近日武汉大学研究工程化外泌体hek 293t-exos在患者来源的肿瘤器官中，产生有效的肿瘤抑制作用。
5、目前，mirna可以通过工程化制备。比如真核细胞表达载体感染人真核细胞经过选择，可获得过表达转录生成大量pre-mirna，在细胞中包裹成为mirna外泌体，自然分泌到细胞外，获取的外泌体经验证可以进入肿瘤细胞，改善肿瘤细胞的性质，经动物实验证明对肿瘤治疗和抑制转移有应用前景。
6、本专利技术制备mir-145-5p，通过外泌体导入方式靶向sox2基因，强相互作用消除干细胞性质，研发抑瘤增殖抑制先导物，为控制癌干细胞性的肿瘤治疗应用。
技术实现思路
1、本专利技术为一种含mirna145-5p外泌体制备方法和细胞治疗应用。
2、本专利技术采用基因工程改造的表达质粒转化入人源细胞株，在细胞培养基添加辅助成分后，细胞可以将丰度高的mirna145-5p分子以外泌体形式分泌出胞，释放在上清的外泌体；该外泌体含mirna145-5p分子，该外泌体用于肿瘤细胞抑制增殖，于实验动物抑制肿瘤长大，对癌症治疗有应用意义。
3、所述基因工程重组质粒采用了pgem-t克隆载体和prnat-u6.1/neo表达载体；所述人源细胞为可体外培养繁殖的hek 293t人肾细胞；所述外泌体通过超速离心分级分离而获得并制备；所述细胞试验应用的细胞为绿色荧光标记的nci-h1299人非小细胞肺腺癌细胞，所述动物试验应用的是balb/c裸小鼠、注射动物长成肿瘤的癌细胞为采用mirna145-5p分子外泌体共孵养的绿色荧光标记的nci-h1299人非小细胞肺腺癌细胞。
4、所述细胞表达制备外泌体的条件为，培养液中增加三种辅助培养成份，为铁源(hemin)、丙酮酸钠和羟基丁酸盐(本实验采用羟基丁酸钠)，它们应用量分别为：5-50μmol/l，5-200mmol/l，和5-200mmol/l。
5、所述外泌体为上述细胞条件培养收获培养液通过超速离心分级分离所获得。
6、所制备的该外泌体含mirna145-5p，该外泌体用于培养肿瘤细胞能抑制增殖，于实验动物能抑制肿瘤长大，将对难治性易转移性癌种的临床治疗提供了实验验证和潜在治疗候选物。
7、专利技术实施方式：
8、下面结合附图对本专利技术具体实施方式作进一步详细说明。实施使用的材料方法在常规实验室条件可满足，所用材料、试剂等，均可从商业途径得到。包括如下1-5等5个方面内容：
9、1、mirna145-5p体外合成系统构建。目的：构建表达mirna145-5p转录的核酸序列结构。方法：合成片段聚合酶延伸，转移到克隆载体，重组入prnai载体重组为prnat-u6.1/neo～mir-145-5p。过程如下：
10、1.1、设计合成dna两个片段，设计片段1为65核苷酸：5’-ccgtcaagagcaccttgtcctcacggtccagttttcccaggaatcccttagatgctaagataggg-3’；设计本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.合成miRNA145-5P片段重组入表达载体转化人源HEK293T细胞稳定表达，在培养基添加三种辅助成分进行培养，培养上清液体可以获得富含重组miRNA145-5p的外泌体。
2.权利一中，辅助成分为铁源(Hemin)、丙酮酸盐和羟基丁酸盐。
3.权利要求二中，丙酮酸盐为钠盐，羟基丁酸盐可以用钠、钾、钙、镁盐各单用或复用。
4.权利要求二中，铁源(Hemin)、丙酮酸钠和羟基丁酸盐的应用分别为：5-50μmol/L，5-200mmol/L，和5-200mmol/L。
5.依权利一、二和三，制备的miRNA145-5P外泌体应用于消减腺癌肿瘤干细胞性质、抑制腺癌增殖和转移，降低难治性提高临床治疗效果。
【技术特征摘要】
1.合成mirna145-5p片段重组入表达载体转化人源hek293t细胞稳定表达，在培养基添加三种辅助成分进行培养，培养上清液体可以获得富含重组mirna145-5p的外泌体。
2.权利一中，辅助成分为铁源(hemin)、丙酮酸盐和羟基丁酸盐。
3.权利要求二中，丙酮酸盐为钠盐，羟基丁酸盐可以用钠、钾、...
【专利技术属性】
技术研发人员：毛建平，董明珠，燕舞，王艳玲，赵涌，
申请(专利权)人：江西北正干细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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