【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基于界面增强和纳米信标的核酸特异位点修饰的电化学发光(ecl)检测方法、ecl检测方法中使用的基底电极、传感器及它们的制备方法、以及试剂盒。
技术介绍
1、核酸，例如dna和rna中存在着大量的化学修饰，这些化学修饰在不改变核酸序列的前提下，作为一种调控机制动态地调节着基因的表达。
2、dna甲基化(dna methylation)是一类发生在胞嘧啶5号位碳原子上、可稳定遗传的表观修饰，在动、植物基因组中广泛存在。dna甲基化在哺乳动物的生长发育过程中广泛参与多种生理过程，包括基因沉默、基因印记(genomic imprinting)、x染色体失活以及疾病的发生等。
3、部分肿瘤的发生伴随着特定基因的高甲基化事件，而且基因局部的高甲基化事件早于细胞的恶性增生发生，因此特定基因的甲基化水平的检测可作为肿瘤早期预测和诊断的重要依据之一。例如，早期的结直肠癌(crc)筛查检测即是基于表观遗传的生物标志物进行的，fda已批准通过检测特定基因启动子cpg甲基化的增加来进行crc的早期筛查和辅助诊断(参见非专利文献1)。另外，不同肿瘤类型发生高甲基化的抑癌基因不同，例如卵巢癌中，抑癌基因rassf1a、brca1、apc、cdkn2a等呈高甲基化状态，乳腺癌中，抑癌基因pcdhb15、wbscr17、igf1、gypc等呈高甲基化状态(参见非专利文献2)。通过对这些特定抑癌基因甲基化水平进行检测，不仅可加强特定肿瘤的筛查和诊断，而且也有助于肿瘤针对性治疗效果的评估以及预后观察。
4、目前dn
5、但是，亚硫酸氢盐处理需要在严格的化学和温度条件下进行，且pcr或测序检测操作复杂，需要专业技术人员以及专业设备，使得该检测方法效率低、耗时长、成本高。因此，迫切需要发展简单、快速、灵敏的甲基化dna检测方法。
6、近期，基于特异性抗体对甲基化位点识别的甲基化dna检测方法引起了关注。这类检测方法不需要核酸预处理，且可以通过对特异性抗体标记不同信标，进行电化学(例如非专利文献3)、荧光等检测。
7、近年发展起来的ecl技术已在生物分析，例如肿瘤蛋白标记物检测方面得到广泛应用(例如非专利文献4)。ecl技术是利用电化学原理在电极表面进行电化学反应产生激发态而引发特异性发光的方法。由于ecl是电致发光，相对于荧光而言，不需要外加激发光源且没有光漂白和光干扰等影响，因此具有设备简单、成本低廉、背景信号低、检测灵敏度高等优点。
8、但是，目前的ecl检测方法的灵敏度、特异性等检测性能还需要进一步的提高。
9、现有技术文献
10、非专利文献
11、非专利文献1：yvette n lamb et al.，epi2.0ce：a blood-basedscreening test for colorectal cancer，mol diagn ther.2017 apr；21(2):225-232
12、非专利文献2：洪婷婷，dna表观遗传修饰的特异性检测，武汉大学，2017年，博士学位论文
13、非专利文献3：eloy povedano et al.，amperometric bioplatforms to detectregional dna methylation with single-base sensitivity，anal.chem，2020，92，5604-12
14、非专利文献4：xiaoming zhou et al.，synthesis，labeling and bioanalytical applications of a tris(2,2`-bipyridyl)ruthenium(ii)-based electrochemiluminescence probe，nat protoc 2014may；9(5)
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的课题
2、本专利技术的专利技术人通过采用ecl纳米信标并结合特异性抗体对甲基化位点的识别反应，提供了一种对核酸特异位点修饰进行简单、灵敏、快速且通用的电化学发光检测方法，并提交了中国专利申请(申请号：202210592343.6)。
3、在此基础上，专利技术人进一步在增强ecl检测信号、提高检测灵敏度和特异性等方面进行了深入研究，结果发现，通过对电极表面进行纳米功能化修饰，能够制备具有界面增强效应的ecl基底电极、传感器，从而提高了ecl检测灵敏度。
4、即，本专利技术通过基于界面增强和纳米信标的ecl技术，能够提供一种灵敏度高、特异性强、检测限低的核酸特异位点修饰的ecl检测方法。
5、用于解决课题的手段
6、具体而言，本专利技术提供下述技术方案。
7、[1]一种ecl基底电极的制备方法，其包含下述工序：
8、将电催化剂溶液与金属纳米粒子混合后滴加到电极表面，得到电催化剂-金属纳米粒子共修饰的基底电极。
9、[2]根据[1]所述的制备方法，其中，所述电催化剂为过渡金属化合物。
10、[3]根据[1]或[2]所述的制备方法，其中，所述电催化剂为二硒化钼(mose2)。
11、[4]根据[1]～[3]中任一项所述的制备方法，其中，所述金属纳米粒子为选自金(au)纳米粒子、银(ag)纳米粒子、铂(pt)纳米粒子、铜(cu)纳米粒子、钴(co)纳米粒子、铁(fe)纳米粒子、镍(ni)纳米粒子和它们的多元合金纳米粒子中的至少一种。
12、[5]根据[1]～[4]中任一项所述的制备方法，其中，所述金属纳米粒子为金(au)纳米粒子。
13、[6]根据[1]～[5]中任一项所述的制备方法，其中，所述电极为选自玻碳电极(gce)、ito电极、和丝网印刷电极(spe)中的一种。
14、[7]根据[1]～[6]中任一项所述的制备方法，其中，所述电极为玻碳电极(gce)。
15、[8]根据[1]～[7]中任一项所述的制备方法，其中，所述电催化剂的剥离时间为5小时以上。
16、[9]根据[1]～[8]中任一项所述的制备方法，其中，所述电催化剂的剥离时间为5～25小时。
17、[10]根据[1]～[9]中任一项所述的制备方法，其中，所述电催化剂与所述金属纳米粒子的混合比例以3.5mg/ml的mose2和0.5mg/ml aunps的体积比计，为1:1～1:9。
18、[11]根据[1]～[10]中任一项所述的制备方法，其中，所述电催化剂与所述金属纳米粒子的混合比例以3.5mg/ml的mose本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种ECL基底电极的制备方法，其包含下述工序：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述电催化剂为过渡金属化合物。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述电催化剂为二硒化钼(MoSe2)。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其中，所述金属纳米粒子为选自金(Au)纳米粒子、银(Ag)纳米粒子、铂(Pt)纳米粒子、铜(Cu)纳米粒子、钴(Co)纳米粒子、铁(Fe)纳米粒子、镍(Ni)纳米粒子和它们的多元合金纳米粒子中的至少一种。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其中，所述金属纳米粒子为金(Au)纳米粒子。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的制备方法，其中，所述电极为选自玻碳电极(GCE)、ITO电极、和丝网印刷电极(SPE)中的一种。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的制备方法，其中，所述电极为玻碳电极(GCE)。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的制备方法，其中，所述电催化剂的剥离时间为5小时以上。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的制
10.根据权利要求1～9中任一项所述的制备方法，其中，所述电催化剂与所述金属纳米粒子的混合比例以3.5mg/mL的MoSe2和0.5mg/mL AuNPs的体积比计，为1:1～1:9。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的制备方法，其中，所述电催化剂与所述金属纳米粒子的混合比例以3.5mg/mL的MoSe2和0.5mg/mL AuNPs的体积比计，为1:5～1:7。
12.一种ECL基底电极，其是通过权利要求1～11中任一项所述的制备方法制备的。
13.一种ECL传感器的制备方法，其包含下述工序：
14.根据权利要求13所述的制备方法，其中，所述经修饰的捕获核酸为巯基修饰、氨基修饰、或生物素修饰的捕获核酸。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其中，所述经修饰的捕获核酸为巯基修饰的捕获核酸。
16.根据权利要求13～15中任一项所述的制备方法，其进一步包含采用封闭剂将结合了所述捕获核酸的电极表面封闭的工序。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其中，所述封闭剂为小分子封闭剂和/或蛋白质封闭剂。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其中，所述小分子封闭剂为6-巯基-1-己醇(MCH)。
19.根据权利要求17所述的制备方法，其中，所述蛋白质封闭剂为牛血清白蛋白(BSA)。
20.一种ECL传感器，其是通过权利要求13～19中任一项所述的制备方法制备的。
21.一种核酸特异位点修饰的ECL检测方法，其使用了权利要求20所述的ECL传感器，并包含如下工序：
22.根据权利要求21所述的检测方法，其中，所述ECL纳米信标为二抗修饰了的金属掺杂无机氧化物纳米粒子，所述二抗是与所述抗核酸修饰的抗体可发生亲和结合的抗体。
23.根据权利要求22所述的检测方法，其中，所述无机氧化物纳米粒子为二氧化硅纳米粒子、二氧化钛纳米粒子、氧化锌纳米粒子、或氧化铁纳米粒子、或者包覆有二氧化硅、二氧化钛、氧化锌或氧化铁的纳米粒子。
24.根据权利要求22或23所述的检测方法，其中，所述无机氧化物纳米粒子是二氧化硅纳米粒子。
25.根据权利要求22～24中任一项所述的检测方法，其中，所述金属掺杂无机氧化物纳米粒子为掺杂三(2,2’-联二吡啶)钌(Ⅱ)配合物离子(Ru(bpy)32+)的二氧化硅纳米粒子。
26.根据权利要求21～25中任一项所述的检测方法，其中，所述共反应剂为三丙胺。
27.根据权利要求21～26中任一项所述的检测方法，所述核酸修饰为核酸的甲基化修饰、羟甲基化修饰或甲酰化修饰。
28.根据权利要求21～27中任一项所述的检测方法，其中，检测溶液的pH为6.0以上、捕获核酸的浓度为1nM～400nM、捕获核酸的孵育时间为5分钟以上、目标核酸的孵育时间为5分钟以上、抗核酸修饰的抗体的浓度为1μg/mL以上、抗核酸修饰的抗体的孵育时间为5分钟以上、ECL纳米信标的浓度为1μg/mL以上、和ECL纳米信标的孵育时间为5分钟以上。
29.根据权利要求21～28中任一项所述的检测方法，其中，ECL检测溶液的pH为6.5～8.5、捕获核酸的浓度为20nM～100nM、捕获核酸的孵育时间为10分钟以上、目标核酸的孵育时间为10分钟以上、抗核酸修饰的抗体的浓度为2μg/mL以上、抗核...
【技术特征摘要】
1.一种ecl基底电极的制备方法，其包含下述工序：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述电催化剂为过渡金属化合物。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述电催化剂为二硒化钼(mose2)。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其中，所述金属纳米粒子为选自金(au)纳米粒子、银(ag)纳米粒子、铂(pt)纳米粒子、铜(cu)纳米粒子、钴(co)纳米粒子、铁(fe)纳米粒子、镍(ni)纳米粒子和它们的多元合金纳米粒子中的至少一种。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其中，所述金属纳米粒子为金(au)纳米粒子。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的制备方法，其中，所述电极为选自玻碳电极(gce)、ito电极、和丝网印刷电极(spe)中的一种。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的制备方法，其中，所述电极为玻碳电极(gce)。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的制备方法，其中，所述电催化剂的剥离时间为5小时以上。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的制备方法，其中，所述电催化剂的剥离时间为5～25小时。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的制备方法，其中，所述电催化剂与所述金属纳米粒子的混合比例以3.5mg/ml的mose2和0.5mg/ml aunps的体积比计，为1:1～1:9。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的制备方法，其中，所述电催化剂与所述金属纳米粒子的混合比例以3.5mg/ml的mose2和0.5mg/ml aunps的体积比计，为1:5～1:7。
12.一种ecl基底电极，其是通过权利要求1～11中任一项所述的制备方法制备的。
13.一种ecl传感器的制备方法，其包含下述工序：
14.根据权利要求13所述的制备方法，其中，所述经修饰的捕获核酸为巯基修饰、氨基修饰、或生物素修饰的捕获核酸。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其中，所述经修饰的捕获核酸为巯基修饰的捕获核酸。
16.根据权利要求13～15中任一项所述的制备方法，其进一步包含采用封闭剂将结合了所述捕获核酸的电极表面封闭的工序。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其中，所述封闭剂为小分子封闭剂和/或蛋白质封闭剂。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其中，所述小分子封闭剂为6-巯基-1-己醇(mch)。
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄昊，许奇齐，吴小天，鞠熀先，吴洁，
申请(专利权)人：佳能医疗系统株式会社，
类型：发明
国别省市：
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