【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于果蔬采后病害生物防治领域，具体涉及一种复合菌用于猕猴桃采后病害控制及贮藏保鲜的方法。
技术介绍
1、猕猴桃(actinidia chinensis)为猕猴桃科(actinidiaceae)猕猴桃属(actinidia)多年生藤本果。猕猴桃果实富含维生素c及多种氨基酸和矿物质，有着极高的营养价值和独特的风味，被誉为“水果之王”，深受广大消费者的喜爱。我国是猕猴桃栽培面积和产量第一大国。然而，随着国内栽培规模的不断扩大，其贮藏和运输量也越来越大。猕猴桃在采后不同阶段容易造成机械伤口，引起腐烂变质，这对猕猴桃的产业造成了严重的经济损失。采后病害发生的原因是复杂的，包括生理因素如生理衰败等，病理因素如微生物侵染等，物理因素如机械损伤等。病原真菌引起的侵染性病害是猕猴桃最主要的采后病害。研究发现，扩展青霉(penicillium expansum)和灰葡萄孢菌(botrytis cinerea)是猕猴桃采后青霉病和灰霉病的主要致病菌。猕猴桃作为我国主要的经济型水果之一，保持其贮运过程中的良好品质极其重要，因此迫切需要安全、有效的方法控制其采后病害。
2、长期以来，化学杀菌剂作为最有效的方法，一直被广泛应用于果蔬采后病害的控制。然而，对传统化学杀菌剂的过度依赖导致了各种问题的出现，如杀菌剂的残留、对环境的污染和病原体抗性的产生等。因此，寻求安全、有效的控制方法替代化学杀菌剂是目前产业急需解决的关键问题。生物防治是指利用微生物之间的拮抗作用，选用无害的微生物抑制病原菌的生长。拮抗酵母的生理特性使其能够快速、有效地利用
3、目前发现的拮抗微生物有酵母菌、细菌和霉菌，其中酵母菌具有快速增殖、遗传稳定、不产生抗生素、不产生真菌毒素、安全性高等优点，成为研究的热点。有关生防菌的研究多是针对某个单一的菌株，但是在实际生产中往往要面对更复杂的环境。单一菌株的综合防治效果常有变化或不稳定；因此常将拮抗酵母与物理方法、其他拮抗菌、化学添加物等结合使用来提高其防治效果。赵妍等人的研究表明，热空气处理结合季也蒙毕赤酵母(pichiaguilliermondii)能够提高樱桃番茄自身的抗性，减少樱桃番茄采后病害。宋聪报道假丝酵母属(candida sp.)和柠檬形克勒克酵母(kloeckera apiculata)等体积混合用于防治柑橘青霉病。将拮抗酵母与物理方法、其他拮抗菌、化学添加物等结合使用，能够提高其防治效果，但是效果方面还需进一步提高；同时国内外利用拮抗酵母控制猕猴桃采后病害的报道还较少。另一方面化学添加剂虽然可以提高生防效果，但是不可避免的也会带来安全问题。
4、因此，合成复合生防菌群可以提高拮抗酵母的生防效力，改善单一生防菌株在防治效力上的不足，对于猕猴桃采后病害的控制和贮藏品质的提高具有重要的意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术旨在解决所述问题之一。本专利技术的目的是将异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)与河生莱略特氏菌t4(lelliottia annigenat4)、硝基还原假单胞菌t10(pseudomonas nitroreducens t10)创造性的结合，所制备的复合菌能够有效控制猕猴桃采后青霉、灰霉病和自然腐烂的发生，不仅显著提高了单一酵母的生防效力，减少采后病害造成的损失；同时对猕猴桃品质无显著不良影响，且可以缓减其品质劣变，实现猕猴桃贮藏保鲜的目的，取得了意想不到的显著效果，具有潜在的应用价值。
2、本专利技术所提供的河生莱略特氏菌t4，保存于中国湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学的中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为：cctcc no：m 2023924，保藏日期为2023年06月05日，建议的分类命名为河生莱略特氏菌t4(lelliottia annigenat4)。
3、本专利技术所提供的硝基还原假单胞菌t10，保存于中国湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学的中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为：cctcc no：m 2023925，保藏日期为2023年06月05日，建议的分类命名为硝基还原假单胞菌t10(pseudomonasnitroreducens t10)。
4、为实现以上目的，本专利技术提供方案如下；
5、利用复合菌控制猕猴桃采后病害及贮藏保鲜的方法，按照下述步骤进行：
6、(1)首先将异常威克汉姆酵母接种在nydb培养基中进行第一次活化，得到活化液；然后，吸取活化液转接入新的nydb培养基中进行第二次活化，得到酵母培养液，再经离心后得到菌泥，用无菌生理盐水洗涤后，配制得到异常威克汉姆酵母菌悬液，待用；
7、(2)将河生莱略特氏菌t4和硝基还原假单胞菌t10分别接种到lb固体培养基上，培养至长出单菌落后，分别挑取单菌落接种到lb液体培养基上，培养至对数生长期，获得河生莱略特氏菌t4和硝基还原假单胞菌t10培养液，经离心后得到2种菌的菌泥，用无菌生理盐水洗涤后，配制得到河生莱略特氏菌t4菌悬液和硝基还原假单胞菌t10菌悬液；
8、再将步骤(1)得到的异常威克汉姆酵母菌悬液、河生莱略特氏菌t4菌悬液和/或硝基还原假单胞菌t10菌悬液混合，得到复配菌液；
9、其中当异常威克汉姆酵母菌悬液和河生莱略特氏菌t4菌悬液混合时，其体积比为(1-10):1；当异常威克汉姆酵母菌悬液和硝基还原假单胞菌t10菌悬液混合时，其体积比为(1-50):1；
10、当异常威克汉姆酵母菌悬液和河生莱略特氏菌t4以及硝基还原假单胞菌t10菌悬液混合时，河生莱略特氏菌t4菌悬液和硝基还原假单胞菌t10菌悬液的体积比为(1-10):1，且异常威克汉姆酵母菌悬液与河生莱略特氏菌t4、硝基还原假单胞菌t10两个细菌菌悬液之和的体积比为(1-10):1；
11、(3)选取无病害、无机械损伤、大小均匀的猕猴桃，进行消毒处理，然后用流水冲洗，清洗后的猕猴桃放入已消毒的塑料筐中晾干；在晾干后的猕猴桃赤道部位用打孔器形成统一大小和深度的伤口，每个伤口处加入步骤(2)的复配菌液，静置后接种扩展青霉或灰葡萄孢悬浮液，自然晾干后用保鲜膜将其密封，并放置于恒温恒湿培养箱中培养，由此验证复合菌对猕猴桃采后青霉或/和灰霉病具有良好的控制效果；
12、或者不对猕猴桃进行消毒处理，保持猕猴桃的自然状况放入塑料筐中，将复配菌液均匀喷洒于猕猴桃表面，待猕猴桃自然晾干后，用保鲜膜密封，置于恒温恒湿培养箱中保存，即可实现对猕猴桃采后自然病害的防治及贮藏保鲜。
13、优选的，步骤(1)中所述的nydb培养基(以1l计)为：酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，蒸馏水定容至1000ml，ph自然，115℃灭菌20min；所述第一次活化的条件为28℃培养20h；所述转接的接种量为1-2％(v/v)；所述第二次活化的条件为28℃培养20h；异常威克汉姆酵母菌悬液的浓度为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种复合菌用于猕猴桃采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种复合菌用于猕猴桃采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的NYDB培养基，以1L计为：酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然，115℃灭菌20min；所述第一次活化的条件为28℃培养20h；所述转接的接种量为1-2％(v/v)；所述第二次活化的条件为28℃培养20h；异常威克汉姆酵母菌悬液的浓度为1×108cells/mL。
3.根据权利要求1所述的一种复合菌用于猕猴桃采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，步骤(2)中所述LB液体培养基，以1L计为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水定容至1000mL，自然pH，115℃灭菌20min。
4.根据权利要求1所述的一种复合菌用于猕猴桃采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，步骤(2)中的河生莱略特氏菌T4，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2023924；硝基还原假单胞菌T10，保存
5.根据权利要求1所述的一种复合菌用于猕猴桃采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，步骤(2)中，河生莱略特氏菌T4菌悬液和硝基还原假单胞菌T10菌悬液的浓度均为1×108CFU/mL。
6.根据权利要求1所述的一种复合菌用于猕猴桃采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，步骤(2)中，当异常威克汉姆酵母菌悬液和河生莱略特氏菌T4菌悬液混合时，其体积比为10:1；当异常威克汉姆酵母菌悬液和硝基还原假单胞菌T10菌悬液混合时，其体积比为10:1或50:1；
7.根据权利要求1所述的一种复合菌用于猕猴桃采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，步骤(3)中所述猕猴桃消毒处理的操作为：将猕猴桃浸入含有2％次氯酸钠溶液的水溶液中消毒1～5min。
8.根据权利要求1所述的一种复合菌用于猕猴桃采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，步骤(3)中所述打孔的孔直径4mm，深度3mm；所述静置一段时间为2h；所述扩展青霉或灰葡萄孢悬浮液的浓度均为1×105spores/mL；所述在孔中注入复配和扩展青霉或灰葡萄孢悬浮液的体积比为1:1。
9.根据权利要求1所述的一种复合菌用于猕猴桃采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，步骤(3)中所述恒温培养箱的条件为：20℃，85％RH。
10.根据权利要求1所述的一种复合菌用于猕猴桃采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，步骤(3)中所述塑料筐消毒为清洗干净后晾干，再用75％酒精喷洒消毒。
...【技术特征摘要】
1.一种复合菌用于猕猴桃采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，具体步骤如下：
2.根据权利要求1所述的一种复合菌用于猕猴桃采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的nydb培养基，以1l计为：酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，蒸馏水定容至1000ml，ph自然，115℃灭菌20min；所述第一次活化的条件为28℃培养20h；所述转接的接种量为1-2％(v/v)；所述第二次活化的条件为28℃培养20h；异常威克汉姆酵母菌悬液的浓度为1×108cells/ml。
3.根据权利要求1所述的一种复合菌用于猕猴桃采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，步骤(2)中所述lb液体培养基，以1l计为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水定容至1000ml，自然ph，115℃灭菌20min。
4.根据权利要求1所述的一种复合菌用于猕猴桃采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，步骤(2)中的河生莱略特氏菌t4，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 2023924；硝基还原假单胞菌t10，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 2023925。
5.根据权利要求1所述的一种复合菌用于猕猴桃采后病害控制及贮藏保鲜的方法，其特征在于，步骤(2)中，河生莱略...
【专利技术属性】
技术研发人员：张红印，赵倩华，杨其亚，张晓云，张钰，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。