【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测，具体涉及一种基于以单分子计数为特征的单分子免疫检测技术的用于辅助阿尔茨海默病早期诊断的联检试剂盒。
技术介绍
1、阿尔茨海默病（alzheimer disease，ad）是一种原因不明的慢性神经退行性病变，其病理改变主要表现为β-淀粉样蛋白的沉积导致老年斑，tau蛋白异常磷酸化导致神经纤维缠结，神经元和突触的丢失，临床表现为进行性认知功能减退和非认知性神经精神症状。目前ad的主要诊断手段是神经心理学量表、影像学检查、生物标志物检测等。神经心理学量表评估受试者的认知功能，现主要采用简易精神状态量表、特利尔认知评估量表、长谷川痴呆量表等量表，但由于受试者教育程度及个人理解能力不同，测试结果浮动大；神经影像学检测主要有磁共振成像（mri）、正电子发射（pet）、计算机断层扫描（ct）等，都也是ad诊断的有力证据，ct可以直接显示ad患者脑萎缩现象，但由于软组织分辨力不佳，使其价值有限，mri和pet价格昂贵，不适合人群筛查。
2、对ad的精确和早期诊断有利于患者接受早期医疗干预，从而为延缓ad的发作或疾病进展提供了可能性。脑脊液aβ42/aβ40（或脑脊aβ2）和aβpet均与脑内aβ病理相关，被认为是ad最早的生物标志物。然而，脑脊液分析在诊断期间通常不是一个必选项，因为需要进行侵入性腰椎穿刺。因此，在中国，迫切需要使用具有非侵入性，易得性且具有成本效益的方法来诊断ad。
3、目前，在我国境内上市的阿尔茨海默诊断试剂盒较少，其中国内有深圳安群生物（ad7c-ntp）、β淀粉样蛋白1-4
4、在文献报道方面，专利文献1报道了一种认知症诊断用生物标志物，其将脂肪酸结合蛋白（fabp）家族作为指标用于神经系统变性疾病的诊断。专利文献2报道了一种诊断阿尔茨海默病的联检试剂盒，其将磷酸化tau蛋白、血液蛋白或dna分子标志物中的至少两种用于阿尔茨海默病的检测，通过免疫检测和分子检测两个维度进行联合检测。专利文献3报道了用于阿尔茨海默症早期诊断的试剂盒，其基于化学发光法对血清和血浆中t-tau、p-tau-181、p-tau-217、p-tau-231进行检测。专利文献4涉及诊断阿尔茨海默病的生物标志物和装置，其中的体液生物标志物选自由脑脊液p-tau，脑脊液aβ42/aβ40和血浆p-tau组成的组中的一种或多种，所述装置包括：输入模块，用于输入受试者的临床检测指标，所述临床检测指标包括血浆生物标志物、关键生理指标和核磁共振成像测量；机器学习模块，用于筛选最佳模型，其中所述机器学习利用逐步向后回归和赤池信息准则来筛选最优模型指标；模型确定模块，用于量化roc曲线下面积（auc），并使用delong统计数据确定auc的差异。
5、单分子免疫检测（smd）是以单个分子的分析为基础构建的一种方法，到目前为止，它已经在生命科学的研究中备受关注。近几年来，该方法被应用于细胞成像、蛋白质相互作用的研究以及蛋白质和核酸的定量检测中。在上述提及的应用中，定量检测是以对目标物分子的一个接一个的计数来实现的，这种定量检测手段代表了检测的最终极限。传统的平均测定方法如免疫层析、化学发光、酶联免疫等是以信号强度和目标物浓度之间的关系来定量的。信号强度越高，被测定目标物的浓度越高。与平均测定方法所不同的是，在smd定量方法中，对可以产生信号的分子进行计数，更具有可视性和数字性，保证了较高的重现性和较高的检测灵敏度。由于smd定量检测方法具有平均测定所无法比拟的优点，目前，已经有工作将smd应用到定量分析之中（参见专利文献5）。
6、具体而言，专利文献5为本申请专利技术人的在先申请，涉及利用具有特定粒径（180~400nm）的原位信号增强纳米粒子对待测分子进行标记，使得单分子信号能够被光学成像设备捕获和识别，实现待测分子的超高灵敏度定量检测。其中，使用了原位信号增强纳米粒子和磁珠，基于双抗夹心法，对ctni蛋白、il-6蛋白、dna等进行了单分子免疫检测，获得了较低的检测下限。
7、现有技术文献
8、专利文献1：cn115667927a；
9、专利文献2：cn114324890a；
10、专利文献3：cn114034872a；
11、专利文献4：cn115201495a；
12、专利文献5：cn111771126b。
技术实现思路
1、专利技术所要解决的课题
2、如前文所述，现有技术中报道了一些诊断阿尔茨海默病的单检或联检试剂盒，但基本均是基于传统免疫检测技术、例如放射方法、酶联免疫方法、荧光免疫方法、流式荧光法、胶乳比浊法、生化法、免疫层析法、化学发光方法等来进行检测的试剂盒，这就导致了其灵敏度不够优异。考虑到针对阿尔茨海默症的有些生物标志物在血液（如血清、血浆）中的浓度较低，因而上述传统方法并不能满足要求，容易导致诊断准确性的下降。另外，上述专利文献1~4中虽然涉及了多种不同生物标志物的组合在阿尔茨海默病检测中的应用，但精准度仍有改进的空间。
3、鉴于上述现有技术的状况，本申请的目的在于提供一种以较高的特异性和灵敏度实现对阿尔茨海默病的辅助诊断的联检试剂盒及相关应用。
4、用于解决课题的手段
5、申请人对能够良好地应用于阿尔茨海默病辅助诊断的联检试剂盒进行了深入研究，发现由β淀粉样蛋白、磷酸化tau蛋白和α-突触核蛋白构成的标志物组合能够以较高的准确度用于阿尔茨海默病的辅助诊断，并且还发现了基于以单分子计数为特征的单分子免疫检测技术的包含针对β淀粉样蛋白的抗体、针对磷酸化tau蛋白的抗体和针对α-突触核蛋白的抗体的试剂盒能够以较高的灵敏度和特异性用于阿尔茨海默病的辅助诊断。需要说明的是，虽然现有技术中涉及了β淀粉样蛋白、磷酸化tau蛋白单独作为生物标志物在阿尔茨海默病的辅助诊断试剂盒中的应用，但尚未报道过上述三种标志物的组合在ad的辅助诊断中的应用，更未提及过基于以单分子计数为特征的单分子免疫检测技术的包含针对上述三种标志物的检测试剂的试剂盒。
6、本申请的一个技术方案如下。
7、基于以单分子计数为特征的单分子免疫检测技术的试剂盒，其用于辅助诊断阿尔茨海默病，特征在于，其包含针对β淀粉样蛋白的抗体、针对磷酸化tau蛋白的抗体和针对α-突触核蛋白的抗体。
8、众所周知，在试剂盒的注册申报时需要注明所依托的检测技术，这是因为试剂盒所基于的检测技术直接决定了其组成，例如若为基于elisa的ad试剂盒，则其中必然包含酶等，若为基于化学发光技术的ad试剂盒，则其中必然包含化学发光剂。也即，试剂盒所基于的技术对其保护范围有限定作用，上述方案中的“基于以单分子计数为特征的单分子免疫检测技术”这一特征意味着本专利技术的试剂盒中不会包含酶、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于以单分子计数为特征的单分子免疫检测技术的联检试剂盒，其用于辅助诊断阿尔茨海默病，特征在于，其包含针对β淀粉样蛋白的抗体、针对磷酸化Tau蛋白的抗体和针对α-突触核蛋白的抗体。
2.如权利要求1所述的联检试剂盒，其中，所述β淀粉样蛋白为Aβ-40和Aβ-42。
3.如权利要求1所述的联检试剂盒，其中，所述磷酸化Tau蛋白为p-tau 181和p-tau217。
4.如权利要求1~3中任一项所述的联检试剂盒，其还包含原位信号增强粒子，所述原位信号增强粒子含有荧光材料和载体，且粒径为180～300nm。
5.如权利要求4所述的联检试剂盒，其中，所述载体为聚乙二醇、二氧化硅、聚丙烯酰胺或聚苯乙烯，所述荧光材料为荧光素类发光材料、罗丹明类发光材料、聚集诱导发光材料、量子点类发光材料、或半导体聚合物荧光材料。
6.如权利要求1所述的联检试剂盒，其包含的抗体由针对β淀粉样蛋白的抗体、针对磷酸化Tau蛋白的抗体和针对α-突触核蛋白的抗体组成，试剂盒中还包含缓冲液，所述缓冲液的pH为7.0～7.6，每100mL缓冲液中包含0.5~
7.生物标志物的检测试剂在制备用于辅助诊断阿尔茨海默病的联检试剂盒中的用途，其特征在于，所述生物标志物是由β淀粉样蛋白、磷酸化Tau蛋白和α-突触核蛋白构成的组合。
8.如权利要求7所述的用途，其中，所述β淀粉样蛋白为Aβ-40和Aβ-42，所述磷酸化Tau蛋白为p-tau 181和p-tau 217。
9.一种用于辅助诊断阿尔茨海默病的单分子免疫检测系统，其包含权利要求1～6中任一项所述的联检试剂盒、和光学成像设备，所述光学成像设备包含光源和光学信号采集单元，并且所述检测系统不包括全内反射显微镜、近场显微镜和艾里斑聚焦检测设备，也不包括体积为纳升级别、皮升级别或飞升级别的微反应腔。
...【技术特征摘要】
1.基于以单分子计数为特征的单分子免疫检测技术的联检试剂盒，其用于辅助诊断阿尔茨海默病，特征在于，其包含针对β淀粉样蛋白的抗体、针对磷酸化tau蛋白的抗体和针对α-突触核蛋白的抗体。
2.如权利要求1所述的联检试剂盒，其中，所述β淀粉样蛋白为aβ-40和aβ-42。
3.如权利要求1所述的联检试剂盒，其中，所述磷酸化tau蛋白为p-tau 181和p-tau217。
4.如权利要求1~3中任一项所述的联检试剂盒，其还包含原位信号增强粒子，所述原位信号增强粒子含有荧光材料和载体，且粒径为180～300nm。
5.如权利要求4所述的联检试剂盒，其中，所述载体为聚乙二醇、二氧化硅、聚丙烯酰胺或聚苯乙烯，所述荧光材料为荧光素类发光材料、罗丹明类发光材料、聚集诱导发光材料、量子点类发光材料、或半导体聚合物荧光材料。
6.如权利要求1所述的联检试剂盒，其包含的抗体由针对β淀粉样蛋白的抗体、针对磷酸化tau蛋白的抗体和针对α-突触核蛋白的抗体组成，试剂盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：汤健，安源，官志超，
申请(专利权)人：苏州宇测生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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