用于检测突触囊泡蛋白SV2A的单分子检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及单分子检测方法在检测突触囊泡蛋白SV2A的浓度中的应用，并涉及检测突触囊泡蛋白SV2A浓度的基于计数的单分子检测方法及试剂盒。本发明专利技术首次将基于计数的单分子检测方法用于SV2A浓度的检测中，本发明专利技术的方法通过普通荧光显微镜即可实现，对设备的要求低，并且检测下限低（灵敏度高），检测动态范围宽，且CV值低。CV值低。CV值低。

【技术实现步骤摘要】
用于检测突触囊泡蛋白SV2A的单分子检测方法及试剂盒


[0001]本专利技术属于单分子检测领域，具体涉及用于检测SV2A蛋白（以下，有时简称为SV2A蛋白）的单分子检测方法、相关试剂盒及单分子检测方法在检测SV2A蛋白中的应用。

技术介绍

[0002]突触囊泡蛋白2（synaptic vesicle protein2，SV2）是一类具有12个跨膜结构的糖蛋白，存在于所有突触泡和内分泌泡中。最初是用抗突触泡的单克隆抗体在板鳃鱼的电器官中发现的，其是一个小基因家族，有三种亚型SV2A、SV2B、SV2C。SV2A是分布最广泛的亚型，几乎存在于各种神经元中，在大脑皮质广泛分布，与神经递质的释放、内分泌泡胞吐作用、突触泡稳态的维持等密切相关。SV2A蛋白的数量和功能发生改变时，可通过引起突触结合蛋白1（Syt
‑
1）数量减少，导致抑制性神经递质及兴奋性神经递质释放失衡，进而诱发癫痫，因此有必要对其在脑脊液和外周血中的浓度进行检测，特别是需要能够对SV2A蛋白的浓度的微小变化进行检测的技术。基于此，需要能够对痕量SV2A蛋白进行检测的技术。
[0003]然而，现有技术主要研究了使用PET（正电子发射断层成像）和示踪剂对SV2A蛋白进行成像来进行病理研究，尚未报道针对SV2A蛋白浓度的检测方法，更未报道如何对脑脊液和外周血中的痕量SV2A蛋白进行检测。
[0004]单分子检测（SMD）是以单个分子的分析为基础构建的一种方法，到目前为止，它已经在生命科学的研究中备受关注。近几年来，该方法被应用于细胞成像、蛋白质相互作用的研究以及蛋白质和核酸的定量检测中。在上述提及的应用中，定量检测是以对目标物分子的一个接一个的计数来实现的，这种定量检测手段代表了检测的最终极限。传统的平均测定方法如免疫层析、化学发光、酶联免疫等是以信号强度和目标物浓度之间的关系来定量的。信号强度越高，被测定目标物的浓度越高。与平均测定方法所不同的是，在SMD定量方法中，对可以产生信号的分子进行计数，更具有可视性和数字性，保证了较高的重现性。由于SMD定量检测方法具有平均测定所无法比拟的优点，目前，已经有工作将SMD应用到定量分析之中（参见专利文献1~3）。
[0005]具体而言，专利文献1为本申请专利技术人的在先申请，涉及利用具有特定粒径（180~400nm）的原位信号增强粒子对待测分子进行标记，使得单分子信号能够被光学成像设备捕获和识别，实现待测分子的超高灵敏度定量检测。其中，使用了原位信号增强粒子和磁珠，基于双抗夹心法，对cTnI蛋白、IL
‑
6蛋白、DNA等进行了单分子检测，获得了较低的检测下限，但未提及如何检测SV2A蛋白。需要说明的是，SV2A蛋白与cTnI蛋白、IL
‑
6蛋白等的结构和分子量差别较大，现有技术中甚至没有文献报道过如何测定SV2A蛋白，如何实现其定量检测需要本领域技术人员的大量创造性工作。
[0006]专利文献2为深圳光与生物科技有限公司提出的申请，其涉及一种基于上转换荧光材料的单分子检测方法，具体而言，将被检测样品稀释后滴加到玻璃片或硅片这样的检测基板上，被检测物与生物活性分子B结合，完成后冲洗检测基板，然后滴加已稀释的免疫荧光材料，使生物活性分子A与已经和生物活性分子B结合的被检测物结合，完成后冲洗检
测基板；将处理后的检测基板置于荧光显微镜下，对免疫荧光材料数目进行计数。该文献通过用高浓度稀土掺杂在上转换纳米材料颗粒中，使上转换纳米材料颗粒具有较大的反斯托克斯位移，相比传统使用的有机染料而言，激发光源和发射波段无重叠，且可有效抑制自发荧光背景噪声，能够显著提高检测信号的信噪比。其使用玻璃片或硅片作为载体，而且同样不涉及如何检测SV2A蛋白。
[0007]专利文献3为彩科（苏州）生物科技有限公司提出的申请，其涉及一种多重免疫分子检测方法，包括如下步骤：获得表面连接有捕获分子的编码微球；通过所述捕获分子捕获目标免疫分子并加入酶标试剂，在所述编码微球表面形成酶标记的免疫夹心复合物；将表面修饰有免疫夹心复合物的编码微球驱动到微孔板的微孔中并密封；预定时间后通过光激发所述微孔板进行检测所述微孔板。其原理与美国Quanterix公司的数字PCR技术类似，基于精密微孔板的微孔来实现对单个分子的分离及检测，同样未提及如何检测SV2A蛋白。
[0008]现有技术文献专利文献1：CN111771126A；专利文献2：CN111735964A；专利文献3：CN111060683A。

技术实现思路

[0009]专利技术所要解决的课题如前文所述，现有技术中尚未报道针对SV2A蛋白浓度的检测方法，本领域技术人员面对的是一个尚未涉足的全新领域。免疫诊断领域中，常见的方法有胶体金法、酶联免疫法、免疫层析法、荧光免疫分析法、化学发光法等，本领域技术人员面对多种选择。如何从种类繁多的检测方法中选择能够良好地适合于SV2A蛋白这种特定蛋白质的方法是本专利技术要解决的问题。
[0010]鉴于上述现有技术的状况，本申请的目的在于提供一种以低的成本（不使用微流控芯片，也不使用非常规荧光显微镜）实现优异的检测灵敏度（较低的检测下限）、较宽的检测动态范围和较优异的变异系数的针对SV2A蛋白的检测方法及相关检测试剂盒。
[0011]用于解决课题的手段申请人对SV2A蛋白的检测方法进行了深入研究，令人惊讶地发现，以计数为特征的单分子检测方法特别适合于SV2A蛋白的检测，其原因可能是SV2A蛋白之间不易结合，便于对各个蛋白单独地进行检测和计数。进一步还发现，通过将本专利技术人之前开发的以具有特定粒径的原位信号增强粒子和双抗夹心法为特征的单分子检测体系应用于SV2A蛋白的检测中时，可获得令人满意的检测灵敏度、较宽的动态检测范围和极低的变异系数，能够满足对痕量SV2A蛋白的检测需求。
[0012]本申请的一个技术方案如下。
[0013]检测突触囊泡蛋白SV2A浓度的基于计数的单分子检测方法，其包括以下步骤：（1）将能够与突触囊泡蛋白SV2A结合的捕获抗体固定到磁珠上，加入含有突触囊泡蛋白SV2A的样品，使突触囊泡蛋白SV2A的第一位点与捕获抗体结合，从而捕获样品中的突触囊泡蛋白SV2A；（2）加入能够与突触囊泡蛋白SV2A的第二位点结合的检测抗体，使检测抗体与突
触囊泡蛋白SV2A的第二位点结合，然后加入能够直接或间接与检测抗体结合的原位信号增强粒子；或者先将检测抗体与原位信号增强粒子结合而形成复合物，再将该复合物加入；所述原位信号增强粒子的粒径为180nm~350nm，且含有荧光材料及载体，（3）用光学成像设备将所述原位信号增强粒子发出的荧光信号成像；（4）对原位信号增强粒子的个数进行统计，进一步计算得到样品中突触囊泡蛋白SV2A的浓度，其中，步骤（1）和（2）可以分别替换为下述的步骤（1
’
）和（2
’
），（1
’
）将检测抗体与样品混合，使其与样品中的突触囊泡蛋白SV2A的第二位点结合，然后加入能够直接或间接与检测抗体结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测突触囊泡蛋白SV2A浓度的基于计数的单分子检测方法，其包括以下步骤：（1）将能够与突触囊泡蛋白SV2A结合的捕获抗体固定到磁珠上，加入含有突触囊泡蛋白SV2A的样品，使突触囊泡蛋白SV2A的第一位点与捕获抗体结合，从而捕获样品中的突触囊泡蛋白SV2A；（2）加入能够与突触囊泡蛋白SV2A的第二位点结合的检测抗体，使检测抗体与突触囊泡蛋白SV2A的第二位点结合，然后加入能够直接或间接与检测抗体结合的原位信号增强粒子；或者先将检测抗体与原位信号增强粒子结合而形成复合物，再将该复合物加入；所述原位信号增强粒子的粒径为180nm~350nm，且含有荧光材料及载体，（3）用光学成像设备将所述原位信号增强粒子发出的荧光信号成像；（4）对原位信号增强粒子的个数进行统计，进一步计算得到样品中突触囊泡蛋白SV2A的浓度，其中，步骤（1）和（2）可以分别替换为下述的步骤（1
’
）和（2
’
），（1
’
）将检测抗体与样品混合，使其与样品中的突触囊泡蛋白SV2A的第二位点结合，然后加入能够直接或间接与检测抗体结合的原位信号增强粒子；或者先使原位信号增强粒子与检测抗体结合而形成复合材料，再将该复合材料加入样品中，使该复合材料与样品中的突触囊泡蛋白SV2A的第二位点结合；其中，所述原位信号增强粒子与所述步骤（1）中的原位信号增强粒子相同；（2
’
）将能够与突触囊泡蛋白SV2A结合的捕获抗体固定至磁珠上，然后加入至步骤（1
’
）的体系中，使所述捕获抗体与所述突触囊泡蛋白SV2A的第一位点结合，从而将突触囊泡蛋白SV2A捕获...

【专利技术属性】
技术研发人员：王培昌，王小灵，官志超，安源，
申请(专利权)人：苏州宇测生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：