【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及荧光探针检测，尤其涉及一种基于原位测序的亚细胞分析方法。
技术介绍
1、生物体功能是通过不同细胞类型的协同作用来执行的，每个细胞的身份和功能由其基因表达程序决定，而基因表达程序又由细胞的分化路径以及来自周围细胞和细胞外基质的外部刺激决定。传统方法可以将生物体组织破坏后研究基因表达从而推断各个器官功能，但该方法破坏生物体组织结构因而不能推断组织中不同细胞类型的转录水平分子状态。随着细胞培养研究的发展，需要新的技术方法以了解复杂器官组织中不同细胞类型之间的相互作用。
2、空间转录组学是一个快速发展的领域，随着多路复用原位技术的最新发展，以前所未有的分辨率为基因组和转录组的空间成像铺平了道路。特定组织细胞中基因表达模式的空间分析可以提供复杂的分子图谱，从而允许转录物的量化和对特定环境中细胞功能的理解。然而目前的生物技术对于组织的细胞分析来说依然存在实验操作繁琐，同时不能实现亚细胞层面分析的问题。
3、有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基于原位测序的亚细胞分析方法，该方法直接根据组织样本rna序列设计特异性靶向探针，原位进行杂交并扩增，进而利用荧光信号实现目标基因的原位检测。
2、具体地，本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术提供了一种基于原位测序的亚细胞分析方法，包括如下步骤：
4、s1、合成锁式探针；所述锁式探针包括5’靶向序列、条形码序列、通用序列和
5、s2、将所述锁式探针与对应样本共孵育，所述锁式探针与目标基因靶向区域的rna序列原位杂交，形成dna-rna夹板结构；加入dna连接酶，将所述锁式探针首尾连接形成环状dna分子；加入所述通用序列的互补序列，利用滚环扩增，在样本原位得到扩增产物；
6、s3、利用所述条形码序列，对所述扩增产物进行原位荧光解码及数据分析。
7、本专利技术所述方法不局限于具体生物样本来源，可针对不同生物样本(如小鼠脑、人乳腺癌组织等)的基因序列结构分别选取特定靶向区域，再根据确定的目标基因rna序列设计特异性锁式探针。
8、优选地，本专利技术所述锁式探针包括两个条形码序列，分别为第一条形码序列和第二条形码序列；所述第一条形码序列和所述第二条形码序列分布在所述通用序列的两侧。
9、更优选地，本专利技术所述锁式探针由5’靶向序列、第一条形码序列、通用序列、第二条形码序列和3’靶向序列顺次连接得到。
10、在本专利技术中，所述目标基因靶向区域优选至少包括两个外显子。
11、更优选地，所述5’靶向序列和所述3’靶向序列的总长度为15-50bp；和/或，所述条形码序列的长度为14-20bp；和/或，所述通用序列的长度为18-26bp。
12、上述优选方案获得的锁式探针具有更强的靶向性，有助于降低不同基因间的相互干扰。
13、在本专利技术提供的较为优选的具体实施方式中，所述锁式探针选自seq id no.01、seq id no.02、seq id no.03、seq id no.04、seq id no.05、seq id no.06、seq id no.07中的至少一种。
14、将上述锁式探针应用于本专利技术基于原位测序的亚细胞分析方法，在单基因样本检测及多基因样本检测中均可获得良好的检测结果，且在多基因样本检测中不发生相互干扰。
15、进一步地，本专利技术在获得锁式探针后，将所述锁式探针与对应样本共孵育，所述锁式探针与目标基因靶向区域的rna序列原位杂交，形成dna-rna夹板结构；加入dna连接酶，将所述锁式探针首尾连接形成环状dna分子；加入所述通用序列的互补序列，利用滚环扩增，在样本原位得到扩增产物。
16、本专利技术对上述各反应所用体系及条件参数不作特别限定，本领域常规采用的反应体系及反应方法均可。
17、进一步地，本专利技术在样本原位得到扩增产物后，利用所述条形码序列，对所述扩增产物进行原位荧光解码及数据分析。
18、本专利技术对所述原位荧光解码及数据分析的具体方法不作特别限定，本领域常规思路均可。
19、在本专利技术提供的其中一种较为优选的实施方式中，所述原位荧光解码的方法为：基于荧光探针解码检测信号。
20、更具体地，所述原位荧光解码的方法为：
21、(1)合成荧光探针；所述荧光探针的核苷酸序列与所述条形码序列相同；
22、(2)将滚环扩增完成后的组织样本与所述荧光探针杂交，然后对杂交后的荧光探针信号及背板进行成像。
23、在本专利技术提供的另外一种较为优选的实施方式中，所述原位荧光解码的方法为：基于合成荧光产物解码检测信号。
24、更具体地，所述原位荧光解码的方法为：
25、(1)合成通用引物；所述通用引物的核苷酸序列与所述通用序列相同；
26、(2)将滚环扩增完成后的组织样本与所述通用引物杂交，加入聚合酶和不同荧光修饰的碱基进行反应，对反应后合成产物的荧光信号及背板进行成像。
27、本专利技术提供的方法可针对不同生物样本设计特异性杂交探针，从而在亚细胞层面实现原位测序。在更为具体的实施方式中，本专利技术针对小鼠脑以及人乳腺癌设计特异性锁式探针，将设计完成的锁式探针靶向到样本的rna序列上，同时完成锁式探针的连接并扩增。
28、对于单基因样本的检测，本专利技术先合成对应引物，靶向到组织样本上，连接完成后加入通用引物序列，同时加入atcg四种碱基以及带有cy3标记的c碱基混合液，完成扩增后检测荧光信号，实现相应组织单基因检测。
29、对于多基因样本的检测，本专利技术先合成对应探针，靶向连接并完成扩增后，加入预先混合好的荧光探针进行孵育，通过解码不同荧光探针的信号顺序从而实现在亚细胞层面对多种基因的原位测序。
30、在可选的另一方法中，本专利技术先合成两段通用引物序列，在生物样本扩增完成后依次进行杂交，杂交完成后加入带有不同荧光标记的碱基，通过合成的方式实现原位测序的目的。
31、更为具体地，本专利技术提供了一种基于原位测序的亚细胞分析技术，包括如下步骤：
32、(1)设计引物：针对小鼠脑以及人乳腺癌组织，分别选取256种基因，根据其序列结构分别选取特定靶向区域，该靶向区域选取应跨两个外显子且保证每个基因互不干扰；根据确定的目标基因的rna序列设计特异性锁式探针。锁式探针的靶向区域共30个碱基，与其目标基本的rna序列互补；在两边同时有两条17个碱基的barcode序列，用于扩增后荧光探针的原位杂交以及解码；中间部分为22个碱基的通用序列，加入与其互补的序列后引发锁式探针的滚环扩增；同时合成与barcode序列相的荧光探针用于原位荧光杂交解码。
33、(2)原位杂交和滚环扩增：将合成的锁式探针与对应样本共孵本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于原位测序的亚细胞分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述基于原位测序的亚细胞分析方法，其特征在于，所述锁式探针包括两个条形码序列，分别为第一条形码序列和第二条形码序列；所述第一条形码序列和所述第二条形码序列分布在所述通用序列的两侧。
3.根据权利要求2所述基于原位测序的亚细胞分析方法，其特征在于，所述锁式探针由5’靶向序列、第一条形码序列、通用序列、第二条形码序列和3’靶向序列顺次连接得到。
4.根据权利要求1-3任意一项所述基于原位测序的亚细胞分析方法，其特征在于，所述目标基因靶向区域至少包括两个外显子。
5.根据权利要求4所述基于原位测序的亚细胞分析方法，其特征在于，所述5’靶向序列和所述3’靶向序列的总长度为15-50bp；
6.根据权利要求5所述基于原位测序的亚细胞分析方法，其特征在于，所述锁式探针选自SEQ ID NO.01、SEQ ID NO.02、SEQ ID NO.03、SEQ ID NO.04、SEQ ID NO.05、SEQ IDNO.06、SEQ ID NO.07中的至少
7.根据权利要求1-6任意一项所述基于原位测序的亚细胞分析方法，其特征在于，步骤S3所述原位荧光解码的方法为：基于荧光探针解码检测信号。
8.根据权利要求7所述基于原位测序的亚细胞分析方法，其特征在于，步骤S3所述原位荧光解码的方法为：
9.根据权利要求1-6任意一项所述基于原位测序的亚细胞分析方法，其特征在于，步骤S3所述原位荧光解码的方法为：基于合成荧光产物解码检测信号。
10.根据权利要求9所述基于原位测序的亚细胞分析方法，其特征在于，步骤S3所述原位荧光解码的方法为：
...【技术特征摘要】
1.基于原位测序的亚细胞分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述基于原位测序的亚细胞分析方法，其特征在于，所述锁式探针包括两个条形码序列，分别为第一条形码序列和第二条形码序列；所述第一条形码序列和所述第二条形码序列分布在所述通用序列的两侧。
3.根据权利要求2所述基于原位测序的亚细胞分析方法，其特征在于，所述锁式探针由5’靶向序列、第一条形码序列、通用序列、第二条形码序列和3’靶向序列顺次连接得到。
4.根据权利要求1-3任意一项所述基于原位测序的亚细胞分析方法，其特征在于，所述目标基因靶向区域至少包括两个外显子。
5.根据权利要求4所述基于原位测序的亚细胞分析方法，其特征在于，所述5’靶向序列和所述3’靶向序列的总长度为15-50bp；
6.根据权利要求5所述基于原位测序的亚...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑洪坤，刘敏，张梦龙，李佳，
申请(专利权)人：青岛百创智能制造技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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