【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种基于重组腺病毒的car-nk细胞制备方法及其应用。
技术介绍
1、自然杀伤(nk)细胞是先天免疫系统的重要效应细胞，占血液和淋巴器官中单个核细胞的5％至15％。nk细胞是人体抵御病毒感染和恶性细胞的第一道防线，其既可以直接杀死癌症或感染细胞，也可以间接改善抗体和t细胞介导的反应。此外，nk细胞还具有免疫调节功能，对树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞，以及抗原特异性t细胞和b细胞反应具有调节作用。
2、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)是一种受体蛋白，可以特异性识别靶蛋白并诱导次级信号传导。car主要由三个结构域组成：胞外区、跨膜区和胞内区。胞外结构域包含单链可变片段(single chain variable fragment，scfv)，通常来源于能够特异性识别癌细胞上表达的肿瘤抗原的抗体；跨膜结构域将car结构锚定在效应细胞膜上；胞内活化结构域则会激活下游信号，促进靶细胞的杀伤。
3、与天然nk细胞相比，表达car受体的car-nk细胞有更强的靶向性和抗肿瘤反应。将基因递送到nk细胞上的方法主要有病毒法和非病毒法，其中，病毒法以逆转录病毒和慢病毒为代表；而非病毒法则包括mrna电转、转座子及crispr/cas9介导的方法等。nk细胞对外来遗传物质的敏感性和防御机制，通常会导致低水平的转导，并诱导细胞凋亡，因此，与t细胞相比，nk细胞的转导效率相对较低。
4、目前car-nk细胞的制备主要通过逆转录病毒和慢病毒进行转导。其中
技术实现思路
1、腺病毒载体具有转染效率高、致病性低、滴度高以及在体内不整合到宿主细胞染色体等特点，是基因治疗临床试验及疫苗研发中常用的载体之一。但是，应用最为广泛的5型腺病毒对nk细胞的基因转导效率低。尚未见采用改构的重组腺病毒进行car-nk细胞制备的相关报道，为解决现有技术中存在的问题，本专利技术将提供一种高效、稳定的car-nk细胞制备方案。
2、本专利技术第一方面提供了一种靶向cd19的car，所述car包括靶向cd19的scfv，所述car还包括信号肽、铰链区、跨膜区、共刺激区、或信号转导区中的一种或多种。
3、进一步，所述car包括信号肽、scfv、铰链区、跨膜区、共刺激区、信号转导区顺次相连。
4、进一步，所述car包括信号肽、scfv、铰链区、跨膜区顺次相连。
5、进一步，所述信号肽为cd8α，所述铰链区包括lgg4、lgg4(l)、或cd8α，所述跨膜区包括cd28或cd8α，所述共刺激区包括cd28、4-1bb、或ox40，所述信号转导域为cd3ζ。
6、进一步，所述car包括cd8α信号肽、靶向cd19的scfv、lgg4铰链区、cd28跨膜区、ox40共刺激区、cd3ζ信号转导区顺次相连。
7、进一步，所述car包括cd8α信号肽、靶向cd19的scfv、lgg4铰链区、cd28跨膜区顺次相连。
8、进一步，所述car包括cd8α信号肽、靶向cd19的scfv、lgg4(l)铰链区、cd28跨膜区、4-1bb共刺激区、cd3ζ信号转导区顺次相连。
9、进一步，所述car包括cd8α信号肽、靶向cd19的scfv、cd8α铰链区、cd8α跨膜区、4-1bb共刺激区、cd3ζ信号转导区顺次相连。
10、进一步，所述car包括与seq id no:6至少90％序列同一性的氨基酸序列。
11、进一步，所述car包括与seq id no:8至少90％序列同一性的氨基酸序列。
12、进一步，所述car包括与seq id no:10至少90％序列同一性的氨基酸序列。
13、进一步，所述car包括与seq id no:12至少90％序列同一性的氨基酸序列。
14、本专利技术第二方面提供了一种多核苷酸分子或包含其的载体，所述多核苷酸分子包括编码前面所述的car的核苷酸序列。
15、进一步，所述载体为腺病毒载体。
16、进一步，所述腺病毒载体是pad.nk腺病毒载体。
17、在本专利技术中，所述pkad.nk腺病毒载体是指来源于申请号202110677612.4的专利技术专利，其原理为hadv-5fiber基因改造为人工改造的f11p228r基因的人5型腺病毒，其中f11p228r基因的氨基酸序列如seq id no:19所示(即，mkrarpsedtfnpvypydtetgpptvpfltppfvspngfqesppgvltlkcltpltttggslqlkvgggltvddtngflkenisattplvktghsiglplgaglgtnenklciklgqgltfnsnniciddnintlwtgvnpteancqimnssesndckliltlvktgalvtafvyvigvsnnfnmltthrninftaelffdstgnlltrlsslktplnhksgqnmatgcdcrgdcfcaitnakgfmpsttaypfndnsrekenyiygtcyytasdrtafpidisvmlnrraindetsyciritwswntgdapevqtsattlvtspftfyyiredd)。
18、如本文所用，术语“载体”是指可以转导、转染、转化或感染细胞的试剂，从而使细胞表达除了细胞天然的那些以外的核酸和/或蛋白质，或以细胞非天然的方式表达。核酸从细胞外环境易位到细胞中时，细胞被核酸“转导”。可以使用将核酸转移到细胞中的任何方法；除非另有说明，否则该术语不暗示将核酸递送到细胞中的任何特定方法。核酸转导到细胞中并稳定复制时，细胞被核酸“转化”。载体包括待由细胞表达的核酸(通常是rna或dna)。在本专利技术具体的实施方案中，所述载体的具体类型为腺病毒载体，具体的为改造的pad.nk腺病毒载体。
19、进一步，所述多核苷酸分子包括与seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、或seq id no:11所示的核苷酸序列至少90％序列同一性的核苷酸序列。
20、术语“同一性”是指两个多肽分子之间或两个核酸分子之间的序列相似性。当两个比较序列中的一个位置被相同的碱基或相同的氨基酸残基占据时，则相应的分子在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比对应于两个序列共享的匹配位置数除以比较的位置数再乘以100。通常，当本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向CD19的CAR，其特征在于，所述CAR包括靶向CD19的ScFv，所述CAR还包括信号肽、铰链区、跨膜区、共刺激区、或信号转导区中的一种或多种；
2.根据权利要求1所述的CAR，其特征在于，所述CAR包括与SEQ ID NO:6至少90％序列同一性的氨基酸序列；
3.一种多核苷酸分子或包含其的载体，其特征在于，所述多核苷酸分子包括编码权利要求1或2所述的CAR的核苷酸序列；
4.一种细胞，其特征在于，所述细胞包括权利要求1或2所述的CAR、或权利要求3所述的多核苷酸分子或包含其的载体；
5.一种制备靶向CD19的CAR细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1或2所述的CAR、或权利要求3所述的多核苷酸分子或包含其的载体通过腺病毒转导进入细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括步骤：
7.一种用于治疗或预防癌症的细胞治疗组合物，其特征在于，所述细胞治疗组合物包括权利要求4所述的细胞，或权利要求5或6所述的方法制备的细胞作为活性成分。
8.权利要求1或2
9.权利要求1或2所述的CAR、权利要求3所述的多核苷酸分子或包含其的载体在制备高靶向CD19的CAR表达同时sIL-15低表达的NK细胞中的应用。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求4所述的细胞；
...【技术特征摘要】
1.一种靶向cd19的car，其特征在于，所述car包括靶向cd19的scfv，所述car还包括信号肽、铰链区、跨膜区、共刺激区、或信号转导区中的一种或多种；
2.根据权利要求1所述的car，其特征在于，所述car包括与seq id no:6至少90％序列同一性的氨基酸序列；
3.一种多核苷酸分子或包含其的载体，其特征在于，所述多核苷酸分子包括编码权利要求1或2所述的car的核苷酸序列；
4.一种细胞，其特征在于，所述细胞包括权利要求1或2所述的car、或权利要求3所述的多核苷酸分子或包含其的载体；
5.一种制备靶向cd19的car细胞的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1或2所述的car、或权利要求3所述的多核苷酸分子或包...
【专利技术属性】
技术研发人员：倪苹，朱晓娜，杨月峰，黄园园，张晓艳，王立燕，
申请(专利权)人：北京景达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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