【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种l-阿拉伯糖异构酶突变体在制备d-塔格糖中的应用，属于酶工程。
技术介绍
1、随着中国健康行动的推进以及国民健康意识的提高，人们日益认识到高糖高热饮食导致的肥胖、糖尿病等慢性疾病对人体健康的严重危害。因此，代糖甜味剂的开发成为研究热点。近年来，d-塔格糖作为一种天然的功能性代糖，因具有众多的优良特性而被广泛应用于食品、医药和化妆品等领域。
2、2003年d-塔格糖于欧盟批准上市，同年8月第一次进入商业领域，之后陆续获得美国、澳大利亚、日本、韩国等食品卫生部门批准使用，作为白糖的代替品被大量用于健康饮料以及酸奶、果汁等产品中。国家卫生健康委员会于2014年发布的《关于批准塔格糖等6种新食品原料的公告(2014年第10号)》明确了d-塔格糖是除婴儿食品以外可用于其他食品中的新型食品原料。
3、d-塔格糖可以通过多种方式获得，目前市场上最主要的生产方式是以乳糖为原料制备d-塔格糖，该法经两步工艺进行生产，即乳糖经β-半乳糖苷酶(ec 3.2.1.23)水解获得d-半乳糖，再由l-阿拉伯糖异构酶(l-ai)催化d-半乳糖异构转化生成d-塔格糖。l-ai(ec5.3.1.4)是一种胞内酶，在微生物体内由araa基因编码，属于醛酮异构酶家族(ec5.3.1)，是微生物磷酸戊糖途径中的关键酶，被认为是稀有糖生产中的重要生物催化剂。各学者通过对该酶的立体结构和活性中心探究分析，提出了酮醇异构酶的两种反应机理：烯二醇机理和氢化物转移机理。而且这些酶的催化机制都需要金属离子介导的质子交换，由烯二醇中间产物实
4、由于d-半乳糖到d-塔格糖异构化反应为可逆反应，因此，想要获得更高的d-塔格糖产率，就要使得反应过程更加偏向于产物方向移动，提高l-阿拉伯糖异构酶对d-半乳糖的亲和力。目前，提高l-阿拉伯糖异构酶底物亲和力的策略主要有以下几种：一是寻找更合适的酶种；二是通过蛋白质工程来改造酶的活性位点，并且这也是目前最常用的手段之一。
5、尽管不同来源的l-阿拉伯糖异构酶性质各异，能够在食品、保健品以及医药行业有很大的应用，具有重要的工业价值。然而，仅有的自然界的野生型酶并不能满足现有的需求，某些性质的短板则限制了l-阿拉伯糖异构酶的应用，因此，通过分子手段对l-阿拉伯糖异构酶进行改造，通过定向进化的方式来改良其性质，获得满足工业应用需求的基因，可以使其更好地应用于工业化生产。
技术实现思路
1、本专利技术提供了l-阿拉伯糖异构酶突变体，是在出发序列的基础上，将第19位由酪氨酸突变为谷氨酸或天冬氨酸，或将第185位由甲硫氨酸突变为丙氨酸；或将第279位由苯丙氨酸突变为异亮氨酸。
2、在一种实施方式中，所述出发序列如seq id no.1所示。
3、在一种实施方式中，所述突变体是将seq id no.1所示氨基酸序列的第19位酪氨酸突变为天冬氨酸，获得如seq id no.2所示的突变体y19d。
4、在一种实施方式中，所述突变体是将seq id no.1所示氨基酸序列的第19位酪氨酸突变为谷氨酸，获得如seq id no.3所示的突变体y19e。
5、在一种实施方式中，所述突变体是将seq id no.1所示氨基酸序列的第279位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，获得如seq id no.4所示的突变体f279i。
6、在一种实施方式中，所述突变体是将seq id no.1所示氨基酸序列的第185位甲硫氨酸突变为丙氨酸，获得如seq id no.5所示的突变体m185a。
7、在一种实施方式中，所述突变体是将seq id no.1所示氨基酸序列的第19位酪氨酸突变为谷氨酸，并将第279位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，获得如seq id no.6所示的突变体y19e/f279i。
8、在一种实施方式中，所述突变体是将seq id no.1所示氨基酸序列的第185位甲硫氨酸突变为丙氨酸，并将第279位苯丙氨酸突变为异亮氨酸，获得如seq id no.7所示的突变体m185a/f279i。
9、本专利技术还提供了一种编码上述l-阿拉伯糖异构酶突变体的基因。
10、在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如seq id no.9～14任一所示。
11、本专利技术还提供了携带上述基因的载体。
12、本专利技术还提供了携带上述基因或者上述载体的微生物细胞。
13、在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物细胞包括但不限于细菌细胞或真菌细胞。
14、本专利技术还提供了一种制备d-塔格糖的方法，所述方法为将所述的l-阿拉伯糖异构酶突变体添加至含有乳糖的反应体系中进行反应。
15、在一种实施方式中，所述反应体系以乳糖为底物，还含有mn2+和/或co2+。
16、在本专利技术的一种实施方式中，所述l-阿拉伯糖异构酶突变体的加酶量≥0.2mg/ml；具体可以为：0.2～1.4mg/ml。
17、在一种实施方式中，底物乳糖的浓度为200～700g/l。
18、在一种实施方式中，所述反应体系中，ph为5.0～7.5。
19、在一种实施方式中，所述反应体系中，温度为50～70℃。
20、在一种实施方式中，所述反应体系中，反应的时间为36～60h。
21、本专利技术还提供所述l-阿拉伯糖异构酶突变体或所述方法在制备d-塔格糖方面的应用。
22、有益效果：
23、(1)本专利技术构建了对d-半乳糖催化效率提高的突变体，在制备d-塔格糖的转化率上较野生型有了明显的提高。野生型以d-半乳糖制备d-塔格糖转化率为28.35％，突变体y19e、m185a和f279i制备d-塔格糖转化率分别为40.31％、37.94％和44.72％；野生型以乳糖制备d-塔格糖转化率14.56％，突变体y19e/f279i和m185a/f279i的转化率分别为22.43％和20.89％。
24、(2)本专利技术优化了突变体催化生产d-塔格糖的方法，在55℃，ph 6.0，500g·l-1乳糖浓度，加酶量1.0mg·ml-1，并含mn2+与co2+的条件下，d-塔格糖的转化率可达23.01％。
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1.L-阿拉伯糖异构酶突变体，其特征在于，在出发序列的基础上，具有如下至少一种突变：
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述出发序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为(a)或(b)：
4.编码权利要求1～3任一所述L-阿拉伯糖异构酶突变体的基因。
5.携带权利要求4所述基因的载体。
6.表达权利要求1～3任一所述突变体，或携带权利要求4所述基因，或含有权利要求6所述载体的微生物细胞。
7.一种制备D-塔格糖的方法，其特征在于，将权利要求1～3任一所述的L-阿拉伯糖异构酶突变体在含有乳糖的反应体系中进行反应。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述反应体系还含有Mn2+和/或Co2+。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，反应体系中L-阿拉伯糖异构酶突变体的含量≥0.2g/L，底物乳糖的浓度≥200g/L。
10.权利要求1～3任一所述的L-阿拉伯糖异构酶突变体或权利要求7～9任一所述方法在制备
...【技术特征摘要】
1.l-阿拉伯糖异构酶突变体，其特征在于，在出发序列的基础上，具有如下至少一种突变：
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述出发序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为(a)或(b)：
4.编码权利要求1～3任一所述l-阿拉伯糖异构酶突变体的基因。
5.携带权利要求4所述基因的载体。
6.表达权利要求1～3任一所述突变体，或携带权利要求4所述基因，或含有权利要求6所述载体的微生物细胞。
...【专利技术属性】
技术研发人员：夏伟，吴敬，李娟，黄燕，陈晟，刘展志，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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