牛结节性皮肤病病毒TK基因缺失毒株LSDV-△TK的构建方法技术

本发明专利技术提供牛结节性皮肤病病毒TK基因缺失毒株LSDV‑△TK的构建方法，包括以下步骤：构建缺失TK基因的pUC19T‑LoxP‑pmH5‑EGFP‑LoxP‑△TK转移载体；构建绿色荧光标记毒株LSDV‑LoxP‑pmH5‑EGFP‑LoxP‑△TK；利用Cre‑LoxP重组酶系统，构建TK基因缺失毒株LSDV‑△TK。本发明专利技术采用同源重组技术将LoxP‑pmH5‑EGFP‑LoxP基因表达框定向插入LSDV毒株的病毒基因组TK基因处，构建绿色荧光标记毒株LSDV‑LoxP‑pmH5‑EGFP‑LoxP‑△TK，采用Cre‑Loxp重组酶系统，将EGFP标签切除，构建LSDV‑△TK。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及牛结节性皮肤病病毒tk基因缺失毒株lsdv-△tk的构建方法。

技术介绍

1、牛结节性皮肤病(lumpy skin disease，lsd)又被俗称为牛结节疹、牛结节性皮炎或牛疙瘩皮肤病，是由痘病毒科羊痘病毒属中的成员牛结节性皮肤病病毒(lumpy skindisease virus，lsdv)引起的一种牛的急性、亚急性传染病。该疫病在1929首次出现于赞比亚共和国，其后疫情迅速向中东、东欧和中亚等地区蔓延扩散。2019年8月12日，新疆维吾尔自治区伊犁州发生牛结节性皮肤疫情，这是国内首次确诊lsd疫情。该疫病对我国养牛业造成了重大经济损失，严重影响了畜牧产业的健康发展。目前，还缺少针对该疫病的特异性疫苗和较好的治疗方法与手段。

2、外源基因的插入位置对重组病毒的拯救影响很大。目前研究表明与羊痘病毒毒力相关的蛋白主要包括三类：囊膜蛋白、与核苷酸代谢相关的蛋白以及非必须的衣壳蛋白。羊痘病毒基因组中存有三个复制非必需区：胸苷嘧啶核苷激酶(the thymidine kinase,tk)基因、γ干扰素受体(γ-interferon re本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.牛结节性皮肤病病毒TK基因缺失毒株LSDV-△TK的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤(1)中，所述构建缺失TK基因的pUC19T-LoxP-pmH5-EGFP-LoxP-△TK转移载体的方法为：分别克隆LSDV TK基因上游和下游1000bp同源臂及EGFP表达框，利用重叠PCR方法，将三段DNA片段融合，利用同源重组的方法与经过BamH I和EcoR I双酶切的pUC19T空载体连接，构建pUC19T-LoxP-pmH5-EGFP-LoxP-△TK转移载体。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于...

【技术特征摘要】

1.牛结节性皮肤病病毒tk基因缺失毒株lsdv-△tk的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤(1)中，所述构建缺失tk基因的puc19t-loxp-pmh5-egfp-loxp-△tk转移载体的方法为：分别克隆lsdv tk基因上游和下游1000bp同源臂及egfp表达框，利用重叠pcr方法，将三段dna片段融合，利用同源重组的方法与经过bamh i和ecor i双酶切的puc19t空载体连接，构建puc19t-loxp-pmh5-egfp-loxp-△tk转移载体。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤(2)中，所述构建绿色荧光标记毒株lsdv-loxp-pmh5-egfp-loxp-△tk的方法为：将puc19t-loxp-pmh5-egfp-loxp-△tk转移载体转染vero细胞，随后感染野生型lsdv毒株。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤(3)中，所述利用cre-loxp重组酶系统，构建tk基因缺失毒株lsdv-△tk...

【专利技术属性】
技术研发人员：任善会，孙跃峰，殷相平，陈豪泰，王相伟，王莎莎，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：