一种1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒及其应用与检测方法技术

技术编号：40089228 阅读：8 留言：0更新日期：2024-01-23 15:56

本发明专利技术提供了一种1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒，包括DVH‑1保守序列扩增引物对、探针；所述DVH‑1保守序列扩增引物对包括上游引物和下游引物，序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示；所述探针序列如SEQ ID NO.3所示，且5’端连接荧光报告基团，3’端连接荧光淬灭基团。本发明专利技术还提供了一种上述试剂盒在检测鸭病毒性肝炎中的应用以及1型鸭病毒性肝炎检测方法。本发明专利技术试剂盒采用特定扩增引物对及探针对鸭病毒性肝炎特异性的DVH‑1型保守序列进行检测，准确度高、灵敏性好、特异性强，且检测过程耗时短、不易污染，检测结果更准确。

全部详细技术资料下载

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测，尤其涉及一种1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒及其应用与检测方法。

技术介绍

1、鸭病毒性肝炎(duck viral hepatitis，dvh)是一种传播迅速、高度致死雏鸭的病毒病，主要由三种不同类型的病毒引起，分别是1型、2型和3型鸭肝炎病毒，其中，1型鸭肝炎病毒引起的1型鸭病毒性肝炎(鸭病毒性肝炎dvh-1型)在我国的流行最广。该病主要侵害1周龄雏鸭，主要病理变化是肝脏肿大、出血等，发病率高、死亡率高，给养鸭业带来了巨大的经济损失。

2、目前，关于1型鸭病毒性肝炎抗原的检测方法，主要有病毒中和试验、酶联免疫吸附试验、琼脂扩散试验等。但上述方法存在检测时间长、操作复杂和易污染等问题。

技术实现思路

1、本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种检测时间短、操作简便、不易污染的1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒及其应用与检测方法。

2、本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：

3、一种1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒，包括dvh-1保守序列扩增引物对、探针；

4、所述dvh-1保守序列扩增引物对包括上游引物和下游引物，其序列分别如seq idno.1、seq id no.2所示；

5、所述探针的序列如seq id no.3所示，且其5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。

6、作为本专利技术的优选方式之一，所述探针5’端的荧光报告基团为fam基团，3’端的荧光淬灭基团为bhq1基团。

<p>7、作为本专利技术的优选方式之一，还包括用于荧光定量rt-qpcr检测的预混体系以及阴性对照品、阳性对照品、定量参考品。

8、作为本专利技术的优选方式之一，所述用于荧光定量rt-qpcr检测的预混体系为现有的2×rt-qpcr kit试剂，主要组分包括dna酶、mmlv、pcr buffer、dntps、ung酶、mg2+。

9、作为本专利技术的优选方式之一，所述阴性对照品为te缓冲溶液。

10、作为本专利技术的优选方式之一，所述阳性对照品为含dvh-1型保守序列核苷酸片段的重组质粒；所述dvh-1型保守序列的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述重组质粒由dvh-1型保守序列核苷酸片段通过同源重组克隆方法连接至pmd-18t载体制得。

11、作为本专利技术的优选方式之一，所述量参考品为浓度1.0×1010copies/μl～10copies/μl的所述重组质粒。

12、一种上述1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒在检测鸭病毒性肝炎中的应用。

13、一种1型鸭病毒性肝炎检测方法，采用上述1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒，方法如下：将提取后的核酸样品、预混体系、dvh-1保守序列扩增引物对、探针配置成pcr反应体系，然后进行pcr扩增反应。

14、作为本专利技术的优选方式之一，所述pcr反应体系具体如下：核酸样品2μl，预混体系12.5μl，上游引物1μl(终浓度100～200nm)，下游引物1μl(终浓度100～200nm)，探针1μl(终浓度50～100nm)；

15、反应条件及程序为：(1)ung酶消化，37℃，2min，1循环；(2)反转录，55℃，10min，1循环；(3)预变性，95℃，10s，1循环；(4)变性，95℃，10s；退火、延伸、荧光采集，58℃，30s；40循环；(5)冷却，25℃，10秒，1循环。

16、本专利技术相比现有技术的优点在于：

17、(1)本专利技术试剂盒采用设计的扩增引物对及探针对鸭病毒性肝炎特异的dvh-1型保守序列进行检测，准确度高、灵敏性好、特异性强，能与鸭坦布苏病毒、鸭瘟病毒、鸭副黏病毒进行区分，且检测过程耗时短、不易污染，检测结果更准确；

18、(2)本专利技术所用dna酶和mmlv高效反转录酶，能够减少反应过程中非特异性扩增的发生，大幅提升检测灵敏度和扩增效率；

19、(3)本专利技术优化的pcr缓冲体系与混合酶的组合，有效抑制非特异性产物的产生，能够显著提高pcr扩增效率，使荧光信号更强，灵敏度更高；

20、(4)在试剂盒的检测方法中，本专利技术将pcr反应退火温度控制在58℃，将扩增引物浓度控制在100～200nm，探针浓度控制在50～100nm能获得最佳的荧光信号。

本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒，其特征在于，包括DVH-1保守序列扩增引物对、探针；

2.根据权利要求1所述的1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒，其特征在于，所述探针5’端的荧光报告基团为FAM基团，3’端的荧光淬灭基团为BHQ1基团。

3.根据权利要求1所述的1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒，其特征在于，还包括用于荧光定量RT-qPCR检测的预混体系以及阴性对照品、阳性对照品、定量参考品。

4.根据权利要求3所述的1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒，其特征在于，所述用于荧光定量RT-qPCR检测的预混体系为2×RT-qPCR kit试剂，包括DNA酶、MMLV、PCR Buffer、dNTPs、UNG酶、Mg2+。

5.根据权利要求3所述的1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为TE缓冲溶液。

6.根据权利要求3所述的1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒及其应用与检测方法，其特征在于，所述阳性对照品为含DVH-1型保守序列核苷酸片段的重组质粒；所述DVH-1型保守序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述重组质粒由DVH-

7.根据权利要求6所述的1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒，其特征在于，所述量参考品为浓度1.0×1010copies/μL～10copies/μL的所述重组质粒。

8.一种如权利要求1～7任一所述的1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒在检测鸭病毒性肝炎中的应用。

9.一种1型鸭病毒性肝炎检测方法，其特征在于，采用如权利要求1～7任一所述的1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒，方法如下：将提取后的核酸样品、预混体系、DVH-1保守序列扩增引物对、探针配置成PCR反应体系，然后进行PCR扩增反应。

10.根据权利要求9所述的1型鸭病毒性肝炎检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系具体如下：核酸样品2μL，预混体系12.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，探针1μL；

...

【技术特征摘要】

1.一种1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒，其特征在于，包括dvh-1保守序列扩增引物对、探针；

2.根据权利要求1所述的1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒，其特征在于，所述探针5’端的荧光报告基团为fam基团，3’端的荧光淬灭基团为bhq1基团。

3.根据权利要求1所述的1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒，其特征在于，还包括用于荧光定量rt-qpcr检测的预混体系以及阴性对照品、阳性对照品、定量参考品。

4.根据权利要求3所述的1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒，其特征在于，所述用于荧光定量rt-qpcr检测的预混体系为2×rt-qpcr kit试剂，包括dna酶、mmlv、pcr buffer、dntps、ung酶、mg2+。

5.根据权利要求3所述的1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒，其特征在于，所述阴性对照品为te缓冲溶液。

6.根据权利要求3所述的1型鸭病毒性肝炎检测试剂盒及其应用与检测方法，其特征在于，所述阳性对照品为含dvh-1型保守序...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭学波，吴琼，战爽，胡学文，吴瑶，
申请(专利权)人：汉唐和元武汉科技有限公司，
类型：发明
国别省市：

全部详细技术资料下载我是这个专利的主人