【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分析领域，具体涉及一种基于双步衍生法的用于同时检测生物样本中还原型和氧化型生物氨巯基化合物的分析方法。
技术介绍
1、官能团巯基(-sh)和氨基(-nh2)是生物体内不可缺少的两种官能团，其中巯基的反应活性高，易被氧化生成二硫键。在人体、动物、植物以及微生物中存在大量同时含有氨基和巯基的化合物，最常见的生物氨巯基化合物(biologicalaminothiols，bats)主要包括半胱氨酸(cysteine,cys)、高半胱氨酸(homocysteine,hcy)、谷胱甘肽(glutathione,gsh)和半胱氨酸甘氨酸(cysteinyl glycine,cg)等。由于巯基的不稳定性，通常还原型bats会转化为氧化型bats，比如cys转化为胱氨酸(cystine,cysss)，hcy转化为高胱氨酸(homocystine,hcyss)以及gsh转化为氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,gssg)。这些bats在生物体中参与一系列的生理代谢过程，比如gsh具有很强的还原性，可以清除生物体内过多的自由基，具有抵抗氧化应激和维持氧化还原平衡的作用；hcy的含量被认为是衡量心血管疾病的指标；植物中的cys对重金属具有良好的解毒作用。此外，bats含量的变化也被证明与多种疾病相关，如癌症、心血管疾病、阿尔茨海默病和糖尿病等。因此，建立针对生物巯基化合物的高选择性和高灵敏度的检测方法具有重要的研究意义。
2、基于不同检测技术，许多方法已经被开发并应用于bats的检测分析，其中包括比色法、
3、鉴于目前bats在lc-ms分析方法中存在的各种问题，如何提供一种更稳定准确的能够同时分析还原型和氧化型bats的检测方法，成为了亟待解决的问题。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供一种基于双步衍生法的用于同时检测生物样本中还原型和氧化型生物氨巯基化合物的方法，对bats进行n,n-二甲基-溴乙酰胺(br-dma)和[d0]-/[d3]-二甲氧基甲基苯并异吡喃鎓盐([d0]-/[d3]-dmmic)两种试剂的双步衍生后，利用液相色谱-四级杆/飞行时间串联质谱仪(lc-q-tofms)进行检测。
2、本专利技术的原理如下：
3、
4、为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
5、一种同时检测还原型和氧化型生物氨巯基化合物的方法，对待测样品先后进行巯基保护试剂和[d0]-/[d3]-二甲氧基甲基苯并异吡喃鎓盐两种试剂的衍生后得到衍生后样品，之后将衍生后样品进行液相色谱-质谱检测，得到检测结果。
6、作为本专利技术优选的实施方式，所述待测样品包括对生物样本进行预处理后提取生物样本中的bats。
7、作为本专利技术优选的实施方式，预处理步骤包括采用含有br-dma(优选100mm)和二氯苯丙氨酸(优选10μm)的甲醇和水的混合溶液(优选体积比为4:1)处理待测的生物样本，提取生物样本中的bats。
8、作为本专利技术优选的实施方式，所述bats包括cys、hcy、gsh、cg、cysss、hcyss和gssg。
9、作为本专利技术优选的实施方式，所述巯基保护试剂为br-dma，其结构如式ⅰ所示：
10、
11、所述[d0]-/[d3]-二甲氧基甲基苯并异吡喃鎓盐的结构如式ⅱ所示：
12、
13、其中，x独立地选自h或d。
14、作为本专利技术优选的实施方式，具体包括以下步骤：
15、(1)第一步衍生化反应：待测样品与br-dma溶液在催化剂作用下反应，生成衍生产物；
16、(2)第二步衍生化反应：待测样品与[d0]-/[d3]-二甲氧基甲基苯并异吡喃鎓盐溶液在催化剂作用下反应生成衍生后样品；
17、(3)液相色谱-质谱检测：采用液相色谱-四级杆/飞行时间串联质谱仪检测衍生后样品，对氨巯基化合物进行定性定量分析。
18、作为本专利技术优选的实施方式，步骤(1)所述br-dma溶液包括br-dma的丙酮溶液、甲醇溶液、水溶液等。优选地，所述br-dma溶液由丙酮配置，浓度为100mm；
19、和/或，所述待测样品与br-dma的摩尔比为1:10-100；br-dma的含量相比待测样品远远过量以满足待测样品中的bats充分反应；
20、和/或，所述催化剂为咪唑溶液、吡啶或氨水，优选地，所述催化剂为咪唑溶液，由超纯水配置，浓度为1m；
21、和/或，所述反应温度为室温，所述反应时间为5-10s。
22、作为本专利技术优选的实施方式，步骤(2)所述[d0]-/[d3]-二甲氧基甲基苯并异吡喃鎓盐溶液包括[d0]-/[d3]-二甲氧基甲基苯并异吡喃鎓盐的乙腈溶液、二氯甲烷溶液，优选地，[d0]-/[d3]-dmmic溶液由乙腈配置，浓度为250mm；
23、和/或，所述待测样品与[d0]-/[d3]-二甲氧基甲基苯并异吡喃鎓盐的摩尔比为1:50-200；[d0]-/[d3]-二甲氧基甲基苯并异吡喃鎓盐的含量相比待测样品远远过量以满足待测样品中的bats充分反应；
24、和/或，所述催化剂为咪唑、吡啶等。优选地，所述催化剂为咪唑溶液，由超纯水配置，浓度为1m；
25、和/或，所述反应温度为35-45℃，所述反应时间为45-75min，优选地，所述反应温度为40℃，所述反应时间为1h。
26、作为本专利技术优选的实施方式，步骤(3)具体方法包括：
27、采用安捷伦1290高效液相-6545四极杆飞行时间质谱联用仪；
28、和/或，色谱柱为waters xselect hss t3 column(2.1×150mm,2.5μm)；
29、和/或，喷雾气压20psi，雾化气温度325℃，电压2500v；
30、和/或，流动相a相为水，b相为甲醇；
31、和/或，洗脱梯度为0-1min时b相10％，1-2min内b相线性升至30％，2-7min内b相线性升至35％，7-10min内b相线性升至95％，10-13.5min内b相95％，13.5-14min内b相线性降至10％，14-19min本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时检测还原型和氧化型生物氨巯基化合物的方法，其特征在于，
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品包括对生物样本进行预处理后提取生物样本中的BATs。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，预处理步骤包括采用含有N,N-二甲基-溴乙酰胺和二氯苯丙氨酸的甲醇和水的混合溶液处理待测的生物样本，提取生物样本中的BATs。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述BATs包括半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸甘氨酸、胱氨酸、高胱氨酸和氧化型谷胱甘肽。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述巯基保护试剂为Br-DMA，其结构如式Ⅰ所示：
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述Br-DMA溶液包括Br-DMA的丙酮溶液、甲醇溶液、水溶液，优选地，所述Br-DMA溶液由丙酮配置，浓度为100mM；
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述[d0]-/[d3]-二甲氧基甲
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)具体方法包括：
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)反应生成衍生后样品还进行除杂，具体方法包括：将反应溶液氮气吹干，残渣以含0.3％HCl的超纯水复溶，用二氯甲烷进行萃取除杂。
...【技术特征摘要】
1.一种同时检测还原型和氧化型生物氨巯基化合物的方法，其特征在于，
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品包括对生物样本进行预处理后提取生物样本中的bats。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，预处理步骤包括采用含有n,n-二甲基-溴乙酰胺和二氯苯丙氨酸的甲醇和水的混合溶液处理待测的生物样本，提取生物样本中的bats。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述bats包括半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸甘氨酸、胱氨酸、高胱氨酸和氧化型谷胱甘肽。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述巯基保护试剂为br-dma，其结构如式ⅰ所示：
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
7....
【专利技术属性】
技术研发人员：张芳，冯陈国，陈秀萍，王敏丹，刘莉，
申请(专利权)人：上海中医药大学，
类型：发明
国别省市：
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