【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的kim-1的检测方法和涉及此方法的试剂盒，能够在待测样品中检测kim-1浓度。
技术介绍
1、均相光激化学发光免疫分析技术(amplified luminescent proximityhomogeneous assay linked immunosorbentassay,alphalisa)是以生物分子间相互作用为原理，荧光共振能量转移发光为基础，以硅胶微球为载体，时间分辨荧光为检测模式的免疫学研究技术。分子间相互作用(抗原抗体特异性相互作用)会将供体和受体微球拉近至单线态氧扩散范围以内，即200nm以内，从而激发级联放大的化学发光反应。其发光原理为光激化学发光，供体微球表面涂布光敏剂苯二甲蓝，受体微球表面涂布发光剂二甲噻吩衍生物并螯合有稀土原子铕。因而，当用680nm的激光照射时，供体微球表面光敏剂分解环境中的氧，形成单体氧分子(氧自由基)，单体氧分子扩散到受体微球，将能量最终传递给稀土原子铕，激发波长为615nm、半衰期为0.3s的激发光，可以采用荧光扫描仪检测。
2、肾损伤分子-1(kim-1)又称t细胞免疫球蛋白粘蛋白-1(tim-1)，是一种i型跨膜蛋白，被认为在肾小管间质损伤中发挥作用。该蛋白在近端肾小管细胞的顶端膜上表达，其外显子被裂解并释放到肾小管的管腔中。kim-1是一种磷脂酰丝氨酸受体，可识别凋亡细胞并将其引导至溶酶体。它还是氧化脂蛋白的受体，因此善于接收凋亡细胞发出的"吃我"信号。此外，kim-1还是第一个将肾脏近端
3、急性肾损伤(acute kidney injury,aki)是一系列急性肾脏疾病中的一部分，在临床上被定义为肾功能的迅速丧失。目前，aki是临床上急性病中最常见的严重疾病之一，如果没有及时治疗，可能是致命性的。早期诊断和干预不仅可以为aki患者提供更好的治疗选择，而且可以改善预后，降低死亡率。
4、对动物和细胞培养的研究表明，在aki中，kim-1直接参与近端肾单位隔室上皮的结构、功能完整性的保存和恢复过程。据推测，kim-1可以诱导对死亡细胞残余物的吞噬作用，从而清除近端小管腔中的细胞碎片，并降低滤液流动障碍的可能性。目前多数研究发现尿液kim-1(ukim-1)有助于诊断aki，且具有较高的敏感性和特异性，研究的汇总分析显示，ukim-1诊断aki的估计敏感性为74％，而特异性为84％，这表明ukim-1对aki具有良好的诊断效力。aki可以由许多不同的机制触发，无论刺激原因是什么，aki的发病特征均为血清肌酐水平迅速升高，同时肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,egfr)迅速降低，而ukim-1的升高可能发生在血清肌酐升高之前，在肾小管损伤后24小时内就可以对ukim-1进行检测，来早期发现aki。此外，不同肾病阶段的kim-1值对急诊和危重患者有意义，因为许多研究表明，kim-1可以区分不同类型急性肾小管坏死患者和无aki患者。综上所述，kim-1是一种有前途的识别早期aki的血清标志物。因此，准确快速地检测人血清或尿中的kim-1浓度具有重要的意义。
5、均相光激化学发光免疫分析技术，以时间分辨作为检测平台，背景影响低，可以在较短时间内对样品进行大规模的快速检测，检测灵敏度高，稳定性强，可实现对早期aki的快速评估，具有较为广阔的应用空间。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供具有可以检测待测样品中kim-1含量，效率高、特异性强、灵敏度高、稳定性好等技术特点的一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的kim-1检测方法以及涉及此方法的试剂盒。
2、本专利技术的技术解决方案如下：
3、本专利技术一方面提供了一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的肾损伤分子-1检测方法，所述方法包括以下步骤：
4、1)供体微球与kim-1捕获抗体偶联，其中kim-1捕获抗体的重链可变区和轻链可变区的序列如seq id no.1和seq id no.2所示；
5、2)受体微球与kim-1检测抗体偶联，其中kim-1检测抗体的重链可变区和轻链可变区的序列如seq id no.3和seq id no.4所示；
6、3)利用分析缓冲液分别将偶联于供体微球的kim-1捕获抗体和偶联于受体微球的kim-1检测抗体均稀释成75μg/ml；
7、4)在聚丙烯孔板中依次加入30μl待检测样品、30μl偶联于供体微球的kim-1捕获抗体和30μl偶联于受体微球的kim-1检测抗体，避光震荡孵育20分钟，得到偶联于供体微球的kim-1包被抗体-kim-1抗原-偶联受体微球的kim-1检测抗体荧光免疫复合物，其中荧光免疫复合物经激发光照射供体微球上的光敏剂产生单线态氧，受体微球上的发光剂接受单线态氧能量传递产生荧光，最后上机检测荧光值，根据kim-1抗原标准品的浓度和荧光值建立标准曲线，将待检样品的荧光值代入标准曲线即可计算待检测样品中kim-1的含量。
8、优选地，本专利技术所述步骤3)中的分析缓冲液为ph8.0 50mm tris缓冲液。
9、优选地，本专利技术所述步骤4)中的kim-1抗原标准品的浓度分别为50pg/ml、500pg/ml、1250pg/ml、2500pg/ml、5000pg/ml。
10、再一方面，本专利技术还提供了一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的肾损伤分子-1检测试剂盒，所述试剂盒包括试剂盒本体以及放在试剂盒本体内的多个药剂盒；其中，具有放置偶联kim-1捕获抗体的供体微球的药剂盒，具有放置偶联kim-1检测抗体的受体体微球的药剂盒，具有放置kim-1标准品溶液的药剂盒，具有放置缓冲液的药剂盒。
11、优选地，本专利技术所述试剂盒本体里设有可发性聚苯乙烯泡沫层，试剂盒本体包括盒体与盒盖，盒体与盒盖由酚醛塑料材质的连接轴连接，试剂盒本体内的底部预制有存放碎冰的冰槽。
12、本专利技术是一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的kim-1的检测方法，该检测方法包括：将kim-1捕获抗体和检测抗体在mes标记缓冲液环境下分别共价偶联于供体微球和受体微球表面，1mg微球标记0.1mg抗体，抗体与微球偶联条件为室温避光震荡孵育2小时，利用分析缓冲液(50mm tris,ph8.0)进行洗涤和分离，去除未结合的抗体，之后对偶联了抗体的微球的使用量进行优化，确定适合的微球使用剂量，用分析缓冲液进行稀释，避免检测微球过量。将优化剂量的偶联捕获抗体的供体微球，偶联检测抗体的受体微球和待测样品一起加入聚丙烯孔板中，孵育条件为37℃避光震荡20min，最终形成kim-1捕获本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的肾损伤分子-1检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的分析缓冲液为pH8.0 50mMTris缓冲液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中的Kim-1抗原标准品的浓度分别为50pg/mL、500pg/mL、1250pg/mL、2500pg/mL、5000pg/mL。
4.一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的肾损伤分子-1检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试剂盒本体以及放在试剂盒本体内的多个药剂盒；其中，具有放置偶联Kim-1捕获抗体的供体微球的药剂盒，具有放置偶联Kim-1检测抗体的受体体微球的药剂盒，具有放置Kim-1标准品溶液的药剂盒，具有放置缓冲液的药剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒本体里设有可发性聚苯乙烯泡沫层，试剂盒本体包括盒体与盒盖，盒体与盒盖由酚醛塑料材质的连接轴连接，试剂盒本体内的底部预制有存放碎冰的冰槽。
【技术特征摘要】
1.一种基于均相光激化学发光免疫分析技术的肾损伤分子-1检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的分析缓冲液为ph8.0 50mmtris缓冲液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中的kim-1抗原标准品的浓度分别为50pg/ml、500pg/ml、1250pg/ml、2500pg/ml、5000pg/ml。
4.一种基于均相光激化学发光免疫分析技术...
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