【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及核酸扩增领域，具体涉及一种基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法。
技术介绍
1、在对样本检测时，相比于背景核酸，感兴趣的靶核酸有时候因含量非常低而导致不能够被有效检测[1]，因此需要预先对靶核酸进行适当的富集/扩增[2]。针对靶核酸片段的富集/扩增并结合核酸检测的策略应用范围广泛，比如用于传染病的监测和诊断[3, 4]、病人样本中病毒基因组测序[5]、病原微生物基因型耐药检测[4]、肿瘤诊断和预后[6, 7]等。
2、对于核酸检测，常用的方法包括(毛细管)核酸电泳[8]、sanger测序/二代测序(next-generation sequencing，ngs)/三代测序(third-generation sequencing)[9,10]、基于crispr/cas[11]、使用荧光探针/核酸染料[12, 13]、核酸质谱[7]、指示pcr前后ph差异[14]等。
3、对于靶核酸片段的富集/扩增，常用的方法包括(多重)pcr[15]、恒温扩增[16]、crispr/cas[2]、差异裂解富集病原微生物核酸[17]、固相芯片杂交捕获(microarrayhybridization)[18]、液相杂交捕获(in solution hybridization)[19]、分子倒置探针(molecular inversion prob，mip)捕获[20, 21]、多重连接依赖探针扩增(multiplexligation-dependent probe amplification，mlpa)
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法。
2、本专利技术所提供的基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法，包括如下步骤：
3、s1用于准备带有通用引物结合位点的左侧自由探针、带有通用引物结合位点的右侧自由探针和模板核酸的步骤；
4、s2用于在试管l中将左侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后左侧探针lp（left probe，左侧探针），并立即冰水浴的步骤；
5、s3用于在试管r中将右侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后右侧探针rp（right probe，右侧探针），并用具有3’ ->5’外切酶活性的dna聚合酶进行一次延伸生成退火延伸后右侧探针rp’，之后立即冰水浴的步骤；
6、s4用于对试管l和试管r分别用dna分选磁珠进行分选纯化的步骤；
7、s5用于对步骤s4中的试管l和试管r分选纯化后的产物进行pcr扩增的步骤。
8、进一步，所述s2用于在试管l中将左侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后左侧探针lp，并立即冰水浴的步骤，包括：
9、s21用于对试管l进行高温变性，温度为90 - 100 摄氏度，时间为 3 - 10 分钟，优选98摄氏度，时间3分钟；
10、s22用于对高温变性后的试管l进行低温退火，温度为50 - 72 摄氏度，时间为 1- 60 分钟，优选65摄氏度，时间5分钟；
11、s23用于对低温退火后的试管l进行冰水浴，时间为1 - 60 分钟，优选5分钟。
12、进一步，所述s3用于在试管r中将右侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后右侧探针rp，并用具有3’->5’外切酶活性的dna聚合酶进行一次延伸生成退火延伸后右侧探针rp’，之后立即冰水浴的步骤，包括：
13、s31用于对试管r进行高温变性，温度为90 - 100 摄氏度，时间为 3 - 10 分钟，优选98摄氏度，时间3分钟；
14、s32用于对高温变性后的试管r进行低温退火，温度为50 - 72 摄氏度，时间为 1- 60 分钟，优选65摄氏度，时间为5分钟；
15、s33用于向低温退火后的试管r中使用具有3’->5’外切酶活性的dna聚合酶进行一次延伸，保持温度为65 - 72 摄氏度，时间为5 - 60秒，优选72摄氏度，时间10秒；
16、s34用于将延伸后的试管r进行冰水浴，时间为1 - 60 分钟，优选5分钟。
17、进一步，所述s3用于在试管r中将右侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后右侧探针rp，并用具有3’->5’外切酶活性的dna聚合酶进行一次延伸生成退火延伸后右侧探针rp’，之后立即冰水浴的步骤，还包括：
18、s35用于向步骤s34中的试管r中加入蛋白酶k以降解dna聚合酶，温度为37 - 65摄氏度，时间为 5 - 60分钟，优选65摄氏度，时间30分钟；
19、s36用于将步骤s35中的试管r进行高温变性，温度为90 - 100 摄氏度，时间为 3- 10 分钟，优选98摄氏度，时间10分钟；
20、s37用于将步骤s36中的试管r进行低温退火，温度50 - 72 摄氏度，时间为 1 -60 分
21、钟，优选65摄氏度，时间5分钟；
22、s38用于将步骤s37中的试管r进行冰水浴，时间为1 - 60 分钟，优选5分钟。
23、进一步，所述s4用于对试管l和试管r分别用dna分选磁珠进行分选纯化的步骤，
24、包括：
25、s41分别向步骤s23中的试管l和步骤s38中的试管r中加入适量磁珠，并采用一轮法进行分选纯化。
26、进一步，所述s5用于对步骤s4中的试管l和试管r分选纯化后的产物进行pcr扩增的步骤，包括：
27、s51用于超量上游引物f和模板核酸中的痕量lp优先退火和延伸而产生痕量的f’；
28、s52用于f’和rp’退火并发生f’的延伸；
29、s53用于上游引物f和下游引物r以步骤s52后的产物为模板进行正常的pcr扩增。
30、本专利技术所提供的基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法，相较于传统的扩增方法具有的优点：
31、1、相较于杂交捕获的方法，本申请具有高性能的同时，对核酸需求量小，测试时间短且测试成本低；
32、2、相较于mip捕获法，本申请所用探针短，不会影响靶核酸的捕获效率；
33、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法，其特征在于，所述S3用于在试管R中将右侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后右侧探针Rp，并用具有3’ -> 5’外切酶活性的DNA聚合酶进行一次延伸生成退火延伸后右侧探针Rp’，之后立即冰水浴的步骤，还包括：
3.如权利要求2所述的基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法，其特征在于，所述S4用于对试管L和试管R分别用DNA分选磁珠进行分选纯化的步骤，
4.如权利要求3所述的基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法，其特征在于，所述S5用于对步骤S4中的试管L和试管R分选纯化后的产物进行PCR扩增的步骤，包括：
【技术特征摘要】
1.一种基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法，其特征在于，所述s3用于在试管r中将右侧自由探针和模板核酸进行退火程序生成退火后右侧探针rp，并用具有3’ -> 5’外切酶活性的dna聚合酶进行一次延伸生成退火延伸后右侧探针rp’，之后立即冰...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴康，东亚娟，张腾，范小勇，罗卫峰，赵建华，纪逸群，
申请(专利权)人：上海锐赛循益生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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