【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，特别涉及一种高产虾青素的红发夫酵母菌株及其制备虾青素的方法。
技术介绍
1、虾青素属于萜烯类不饱和化合物，因其优异的抗氧化性和出色的着色能力而闻名。据报道，其抗氧化活性比β-胡萝卜素高10倍，比α-生育酚高100倍，是维生素c的6000倍。此外，虾青素还具有抗炎、抗肿瘤、抗癌、抗糖尿病和免疫调节活性。因此，虾青素在水产养殖、食品、化妆品、保健品和制药等多个行业广泛应用。
2、2021年，有研究以一株高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母菌株为起点，将来自副球菌的β-胡萝卜素酮化酶（pscrtw）基因和雨生红球藻β-胡萝卜素羟基化酶（hpcrtz）基因融合表达，然后用定位信号序列标记融合基因，将产物定向到合成和储存β-胡萝卜素的细胞器内质网和过氧化物酶体以及脂滴中，由此产生的yl17菌株在小规模分批投料培养12天后达到了858 mg/l (16.7 mg/g dcw)的虾青素滴度。
3、红发夫酵母合成虾青素的比例可占细胞类胡萝卜素的50％～85％，并且在生长速度、细胞密度、抗污染等方面具有突出优势，被认为是虾青素生产的重要细胞工厂。但自然红发夫酵母虾青素产量低，暂未达到上述产量，并且没有通过上述策略构建的基因工程菌株。因此，构建一株高产虾青素的红发夫酵母，解决红发夫酵母低产量高成本的问题，具有重要意义。
4、中国专利cn 112430637 b公开了一种敲除甾醇合成基因提高红发夫酵母虾青素产量的方法。通过敲除红发夫酵母甾醇合成基因，降低甾醇生成对虾青素合成的代谢竞争或减少甾醇对甲
5、中国专利cn 115176024 a公开了红发夫酵母的虾青素高产菌株，通过在诱变条件下诱导红发夫酵母的酵母菌株发生突变，突变后的酵母菌株能够产生大量的类胡萝卜素，特别是大量的虾青素。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种高产虾青素的红发夫酵母菌株及其制备虾青素的方法，能够解决红发夫酵母低产量高成本的问题，创造更好的经济效益。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案如下：
3、一种高产虾青素的红发夫酵母菌株，该红发夫酵母（phaffia rhodozyma）命名为：红发夫酵母 oks phaffia rhodozyma oks，于2023年8月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccno：m 20231401，保藏地址为中国武汉。
4、本专利技术还提供一种高产虾青素的红发夫酵母菌株的构建方法，通过基因工程手段将虾青素合成途径中的关键性限速酶基因靶向表达到红发夫酵母中。
5、所述关键性限速酶基因为虾青素合成酶基因crts。
6、所述的高产虾青素的红发夫酵母菌株的构建方法，通过基因工程手段将虾青素合成酶基因crts，靶向表达到红发夫酵母的脂滴、内质网和过氧化物酶体中，即在所述基因crts上分别添加定位信号序列oleosin、kdel和skl，并将所述基因crts整合到红发夫酵母中，使所述基因crts分别在同一红发夫酵母菌株的三个细胞器中表达。
7、本专利技术所述高产虾青素的红发夫酵母菌株，其代谢产物为虾青素，红发夫酵母菌株通过基因工程手段将虾青素合成酶基因crts，分别添加定位信号序列oleosin、kdel和skl，并整合到红发夫酵母中，使crts基因在同一菌株的三个细胞器中均表达，增加虾青素胞内积累量，从而提高虾青素的产量。
8、本专利技术另提供一种基于所述高产虾青素的红发夫酵母菌株制备虾青素的方法，所述方法的具体步骤为：
9、步骤一：挑取所述高产虾青素的红发夫酵母菌株，接种于第一种子培养基中，进行第一次培养，培养条件为恒温摇床培养，培养温度22℃，转速180rpm，培养时间24h，得到一级种子；
10、步骤二：将所述一级种子以9%的接种量，转接于第二种子培养基中，进行第二次培养，培养条件为恒温摇床培养，培养温度22℃，转速180rpm，培养至对数生长期，od600＝2.5；
11、步骤三：将步骤二所得培养物以10%的接种量，接种于发酵培养基中，培养条件为恒温摇床培养，培养温度22℃，转速180rpm，摇瓶培养120h，得到发酵产物，所述发酵产物为右旋（3r，3′r）结构的天然虾青素。
12、优选的，所述第一种子培养基和第二种子培养基配方组成均为：葡萄糖19～21g/l，蛋白胨19～21g/l，酵母粉9～11g/l。
13、优选的，所述发酵培养基配方组成为：葡萄糖29～31g/l；酵母粉9～11g/l；柠檬酸钠4～6g/l；mgso4•7h2o 2～2.5g/l；kh2po42.5～3.3g/l；feso4•7h2o 87～88mg/l；znso4•7h2o 19～20mg/l；mnso4•h2o 2～3mg/l；硫酸钴0.4～0.5mg/l；cuso4•5h2o 3～4mg/l；生物素0.1～0.2mg/l；vb1 0.1～0.2mg/l；vb6 0.1～0.2mg/l；泛酸钙17～18mg/l；肌醇64～65.5mg/l。
14、本专利技术的进一步有益效果是：
15、本专利技术发酵产物为右旋（3r，3'r）结构的天然虾青素，该菌株所产虾青素已被我国法规允许作为饲料添加剂使用。相较于其他异源生产虾青素的基因工程菌（如大肠杆菌、解脂耶氏酵母和酿酒酵母）来说，本专利技术菌株利用自身天然具有的虾青素合成途径生产虾青素；相较于目前市场上流通的化学合成和雨生红球藻生产的虾青素来说，本专利技术操作简单，生长周期短，能够实现扩大培养和高生物量生产；相较于初始红发夫酵母来说，本专利技术菌株发酵生产虾青素产量提高，降低生产成本。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种高产虾青素的红发夫酵母菌株，其特征在于：该红发夫酵母（Phaffiarhodozyma）命名为：红发夫酵母 OKS Phaffia rhodozyma OKS，于2023年8月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 20231401，保藏地址为中国武汉。
2.一种基于权利要求1所述高产虾青素的红发夫酵母菌株的构建方法，其特征在于：通过基因工程手段将虾青素合成途径中的关键性限速酶基因靶向表达到红发夫酵母中。
3.根据权利要求2所述的高产虾青素的红发夫酵母菌株的构建方法，其特征在于：所述关键性限速酶基因为虾青素合成酶基因CrtS。
4.根据权利要求2或3所述的高产虾青素的红发夫酵母菌株的构建方法，其特征在于：通过基因工程手段将虾青素合成酶基因CrtS，靶向表达到红发夫酵母的脂滴、内质网和过氧化物酶体中，即在所述基因CrtS上分别添加定位信号序列oleosin、KDEL和SKL，并将所述基因CrtS整合到红发夫酵母中，使所述基因CrtS分别在同一红发夫酵母菌株的三个细胞器中表达。
5.一种基于权利要求1
6.根据权利要求5所述的高产虾青素的红发夫酵母菌株制备虾青素的方法，其特征在于：所述第一种子培养基和第二种子培养基配方组成均为：葡萄糖19～21g/L，蛋白胨19～21g/L，酵母粉9～11g/L。
7.根据权利要求5所述的高产虾青素的红发夫酵母菌株制备虾青素的方法，其特征在于：所述发酵培养基配方组成为：葡萄糖 29～31g/L；酵母粉 9～11 g/L；柠檬酸钠 4～6g/L；MgSO4•7H2O 2～2.5 g/L；KH2PO4 2.5～3.3 g/L；FeSO4•7H2O 87～88 mg/L；ZnSO4•7H2O19～20 mg/L；MnSO4•H2O 2～3 mg/L；硫酸钴0.4～0.5 mg/L；CuSO4•5H2O 3～4mg/L；生物素0.1～0.2mg/L；VB1 0.1～0.2mg/L；VB6 0.1～0.2mg/L；泛酸钙17～18mg/L；肌醇64～65.5mg/L。
...【技术特征摘要】
1.一种高产虾青素的红发夫酵母菌株，其特征在于：该红发夫酵母（phaffiarhodozyma）命名为：红发夫酵母 oks phaffia rhodozyma oks，于2023年8月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 20231401，保藏地址为中国武汉。
2.一种基于权利要求1所述高产虾青素的红发夫酵母菌株的构建方法，其特征在于：通过基因工程手段将虾青素合成途径中的关键性限速酶基因靶向表达到红发夫酵母中。
3.根据权利要求2所述的高产虾青素的红发夫酵母菌株的构建方法，其特征在于：所述关键性限速酶基因为虾青素合成酶基因crts。
4.根据权利要求2或3所述的高产虾青素的红发夫酵母菌株的构建方法，其特征在于：通过基因工程手段将虾青素合成酶基因crts，靶向表达到红发夫酵母的脂滴、内质网和过氧化物酶体中，即在所述基因crts上分别添加定位信号序列oleosin、kdel和skl，并将所述基因crts整合到红发夫酵母中，使所述基因crts分别在同一红发夫酵母菌株的三个细胞器中表...
【专利技术属性】
技术研发人员：李海军，刘静，郑德强，贾庆文，张英华，王春喜，刘玉杰，赵玉雪，李倩倩，
申请(专利权)人：山东福瑞达医药集团有限公司，
类型：发明
国别省市：
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