【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及多肽药物及其它功能多肽二硫键鉴定领域，尤其涉及基于高场核磁共振技术检测多肽药物二硫键鉴定的方法。
技术介绍
1、二硫键是由蛋白质或多肽中两个半胱氨酸的巯基通过共价键相连形成的，在蛋白质或多肽的结构、功能、折叠与稳定性中发挥着至关重要的作用。同时，二硫键广泛存在与各类蛋白质和多肽中，在pdb数据库已知的结构中，有近四分之一的蛋白质或多肽具有二硫键。例如在动物毒素中，有超过70％的毒素具有两对以上的二硫键，并且二硫键的错配会导致毒素功能的丧失(mobli m.and king g.,toxicon,2010,56,849-854)。多肽药物以其高安全性、高耐受行性和高效性逐渐成为生物药中最重要的组成部分之一，也受到了医药研发企业的青睐。对于氨基酸数目相对较少的多肽药物而言，其二级结构较少，二级结构之间的相互作用较弱，二硫键对其空间高级结构的形成和稳定极为重要，二硫键的错配会直接导致高级结构的错乱或坍塌从而影响其药效。因此对于多肽药物二硫键的鉴定是多肽药物高级结构鉴定中最重要的组成部分，无论是国内还是国外，含有二硫键的多肽药物在进行申报时均需要提供相应的鉴定结果以证实药物高级结构的正确性。
2、目前多肽二硫键鉴定的主要方法是高级结构解析的方法，即通过液体核磁共振技术或x-ray晶体衍射技术解析出多肽的高分率结构，进而对二硫键进行鉴定。由于多肽分子量小且多数具有较大的柔性，多数难于结晶，因此无法使用x-ray晶体衍射技术解析。液体核磁共振技术可以在近似生理环境下完全无损的研究多肽药物的高级结构，因此液体核磁共振
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提出一种基于高场核磁共振技术鉴定多肽药物二硫键的方法，该方法能够使用低成本、非标记样品和简单的二维(2d)核磁共振实验，绕开依赖进口软件的数据分析和冗杂的高级结构计算过程，直接对多肽药物二硫键进行高可靠性鉴定。
2、针对上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：
3、一种基于高场核磁共振技术鉴定多肽药物二硫键的方法，包括以下步骤：
4、样品制备：将多肽粉末直接溶于水或缓冲体系，制成无标记多肽样品；
5、谱图采集：采集多肽样品的核磁共振2d 1h-1h tocsy谱、2d 1h-13c hsqc谱和2d1h-1h noesy谱；
6、数据分析：分析谱图，提取氨基酸的化学位移归属信息和空间距离约束(即noe信息)，特别是半胱氨酸及附近氨基酸的信息；
7、二硫键鉴定：根据半胱氨酸β碳的化学位移判断半胱氨酸巯基的存在状态，是否以二硫键形式存在，并根据半胱氨酸与其它半胱氨酸及其附近氨基酸残基的noe信息判断半胱氨酸之间是否存在二硫键。
8、进一步地，多肽溶解的缓冲体系的ph为中性或弱酸性，体系中不含有除水分子外其它的含h原子的分子，优选不同盐浓度的pbs缓冲体系。
9、进一步地，缓冲体系中加入3-(三甲基硅基)丙磺酸钠(dss)作为化学位移内标，以获得准确的化学位移值；例如500微升缓冲体系中加入2微升的2wt％的dss。
10、进一步地，多肽样品的浓度大于1mm。
11、进一步地，根据多肽样品不同，使用核磁共振仪器通常需要在700mhz以上。
12、进一步地，tocsy实验的混合时间设置为80ms，noesy实验的混合时间在300ms左右(200-400ms)，具体视多肽的分子量确定，分子量较大时混合时间减少，反之亦然，实验采集时可以采集不同混合时间的谱图进行比较，选择noe信号强且信号没有明显多于混合时间短的实验的noe信号为最佳，如果noesy信号弱且数量少的样品使用roesy实验代替noesy实验。
13、进一步地，提取化学位移信息时，使用tocsy和hsqc对氨基酸残基类型和化学位移进行指认，从noesy谱图中找到所有氨基酸残基主链氨基h和序列前后氨基酸α位1h的noe信号，结合noesy实验确定氨基酸残基之间的序列连接信息。
14、进一步地，提取每一个半光氨酸残基所有氢原子与其它半胱氨酸及序列前后氨基酸的noe信息，提取出这些noe对应的镜像信号的信息。
15、进一步地，半胱氨酸β碳的化学位移大于35ppm时，表明半胱氨酸处于二硫键状态；小于32ppm时，表明半胱氨酸处于巯基还原态，处于32-35ppm之间时，前述的两种状态均有可能，需要进一步验证。
16、进一步地，一个半胱氨酸与另一个半光氨酸及序列前后的氨基酸存在noe信号时，表明两个半胱氨酸临近，如果它们β碳的化学位移属于二硫键状态，表明它们之间形成了二硫键。
17、本专利技术首先利用高场核磁共振仪器(≧700mhz，具体视样品分子量大小等条件而定)高分辨率和高灵敏度的特点，采集了多肽药物的2d 1h-1h tocsy谱、2d 1h-13c hsqc谱和2d1h-1h noesy谱，并解析谱图得到多肽药物结构的化学位移归属，特别是半胱氨酸β碳的化学位移归属。其次，提取每一个半胱氨酸与其它半胱氨酸及其序列前后氨基酸残基的noe信息。最后，根据以上化学位移信息和noe信息，最终对多肽药物的二硫键的连接进行鉴定。
18、相较于现有的技术，本专利技术的有益效果如下：
19、本专利技术提供了一种基于高场核磁共振技术简单且可靠的鉴定多肽药物二硫键的方法，与上文提到高级结构解析的方法相比，该方法绕开了周期长、过程复杂、且需要使用多款暂时无法替代的国外软件辅助的高级结构的计算过程。与上文提到的直接检测二硫键的方法相比，该方法使用高灵敏度和高分辨率的高场核磁共振仪器对样品进行无损的鉴定，高灵敏度和高分辨率提高了半胱氨酸化学位移归属和noe信息的准确性与可分辨性，并且分析时，除了使用已有的分析方法，还创新性的引入了对半胱氨酸和其它半胱氨酸序列前后残基的noe信息分析，进一步提高了二硫键鉴定的可靠性。
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1.一种基于高场核磁共振技术鉴定多肽药物二硫键的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，缓冲体系的pH为中性或弱酸性，体系中不含有除水分子外其它的含H原子的分子。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，缓冲体系选用不同盐浓度的PBS缓冲体系。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，多肽样品的浓度大于1mM，样品中加入3-(三甲基硅基)丙磺酸钠进行化学位移校准。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，高场核磁共振技术使用的核磁共振仪器在700MHz及以上。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采集2D 1H-1H TOCSY谱时的TOCSY实验的混合时间设置为80ms，采集2D 1H-1H NOESY谱时的NOESY实验的混合时间在200-400ms。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，提取化学位移时，使用TOCSY和HSQC对氨基酸残基类型和化学位移进行指认，从NOESY谱图中找到所有氨基酸残基主链氨基H和前后氨基酸α位1H的空间距离约束信息，结合NOESY实
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，提取每一个半光氨酸残基所有氢原子与其它半胱氨酸及序列前后氨基酸的空间距离约束信息，以及提取出这些空间距离约束信息对应的镜像信号的信息。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，半胱氨酸β碳的化学位移大于35ppm时，表明半胱氨酸处于二硫键状态；小于32ppm，表明半胱氨酸处于巯基还原态；处于32-35ppm之间时，前述的两种状态均有存在可能，需要进一步验证。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，一个半胱氨酸与另一个半光氨酸及序列前后的氨基酸存在NOE信号时，表明两个半胱氨酸临近，如果它们β碳的化学位移属于二硫键状态，表明它们之间形成了二硫键。
...【技术特征摘要】
1.一种基于高场核磁共振技术鉴定多肽药物二硫键的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，缓冲体系的ph为中性或弱酸性，体系中不含有除水分子外其它的含h原子的分子。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，缓冲体系选用不同盐浓度的pbs缓冲体系。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，多肽样品的浓度大于1mm，样品中加入3-(三甲基硅基)丙磺酸钠进行化学位移校准。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，高场核磁共振技术使用的核磁共振仪器在700mhz及以上。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采集2d 1h-1h tocsy谱时的tocsy实验的混合时间设置为80ms，采集2d 1h-1h noesy谱时的noesy实验的混合时间在200-400ms。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，提取化学位移时，...
【专利技术属性】
技术研发人员：李红卫，
申请(专利权)人：江苏国源先进仪器技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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