【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及永生化猪脂肪间充质干细胞的构建方法及其应用。
技术介绍
1、脂肪组织是人和动物体内重要的物质之一，是机体能量储存的主要方式，脂肪代谢是机体最基本的能量代谢方式，脂肪代谢失衡会严重影响机体的生命活动，近年来由于脂肪沉积过多而引起机体脂类代谢紊乱，产生胰岛素抵抗和胰高血糖素血症，进而导致各种疾病，如肥胖、高血压、高血脂、冠心病、动脉粥样硬化和糖尿病等，已成为世界性的医学难题。猪与人类具有相似的代谢功能、心血管系统以及成比例的器官大小，且猪自身有足够厚的脂肪层，不需要混合不同层或不同动物的脂肪组织，也能得到足够多的脂肪细胞进行研究。因此科研人员更倾向使用猪作为研究人类能量代谢和肥胖的动物模型。在畜牧生产中，虽然已获得了大量的优良品种，但是动物机体的脂肪过度沉积和异位沉积仍是影响育种工作的难题，因此了解动物机体脂肪沉积的规律及其分子调控机理是顺利开展动物育种工作最关键的前提，同时也是科研工作者函待解决的难题。
2、脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ascs)是研究脂肪代谢较多的一类来源于脂肪组织的成体干细胞，研究表明，各种物种的脂肪间充质干细胞都能表达干细胞的特性，即高度的自我更新复制能力，分化为多种功能细胞的潜能。猪脂肪间充质干细胞因其来源广泛，储备充足的优点，在研究干细胞方面，有极大的优势，现阶段作为研究脂肪代谢和其相关疾病的模型不断的被研究。但是由于从动物体分离出的脂肪间充质干细胞在体外培养的增殖能力是有限的，不能进行无限
3、sv40大t抗原是一种可以使动物细胞获得永生化的关键物质。sv40大t抗原可干扰视网膜母细胞瘤易感蛋白prb和肿瘤抑制蛋白p53这两种会使细胞进入复制衰老阶段的细胞周期调节因子。此外，sv40大t抗原能够激活转导细胞中的端粒酶活性。给细胞转染sv40大t抗原是动物细胞永生化的一个关键因素。迄今为止，已有多篇文章报道建立了啮齿动物和人类的永生化脂肪间充质干细胞系，它们都利用了sv40大t抗原。在本研究中，猪原代脂肪间充质干细胞将通过慢病毒转导sv40大t抗原，建立永生化细胞系。
4、厚朴酚(5,5'-diallyi-2,2'-dihydroxybiphenyl,c18h18o2)属于新木脂素类化合物，是厚朴根皮中的主要成分之一。目前，关于厚朴酚的研究很多，厚朴酚具有丰富的药理作用，比如抗氧化、抗脂质过氧化、抗炎症、抗肿瘤、抗菌、中枢神经抑制作用和降低胆固醇作用等。而厚朴酚在脂肪细胞分化中的研究较少，特别是猪脂肪间充质干细胞的分化还没有任何相关报道。
5、猪是世界上肉类生产的主要家畜品种，此外，由于它们在解剖学和生理学方面与人类高度相似，它们也越来越多地被用作生理和药理研究的动物模型。因此，猪脂肪间充质干细胞在猪肉品质和医学猪模型的建立中具有重要的应用价值。尽管如此，但是由于从动物体分离出的脂肪间充质干细胞在体外培养的增殖能力是有限的，不能进行无限的增殖复制，成为限制研究进展的一个重大不利因素。迄今为止，小鼠脂肪间充质干细胞的永生化细胞系已经构建成功，可以在体外进行多年的指数扩增而不丧失干细胞能力。在猪中建立永生化的猪脂肪间充质干细胞系，将提供充足的细胞进行机理研究，从而促进猪脂肪代谢研究的发展，并最终将其应用于畜牧业和医学。
技术实现思路
1、在本专利技术中，通过将表达猴病毒40(sv40)大t抗原的慢病毒质粒转导到猪脂肪间充质干细胞系，建立了具有猪脂肪间充质干细胞特性的细胞系，并利用此细胞系研究厚朴酚对猪脂肪间充质干细胞分化的影响。
2、本专利技术首先提供一种具有猪脂肪间充质干细胞特性的细胞系，其中导入并表达猴病毒40大t抗原的猪脂肪间充质干细胞系而建立。
3、优选地，所述导入并表达猴病毒40大t抗原是通过慢病毒质粒转导到猪脂肪间充质干细胞系中。
4、本专利技术由此提供一种制备具有猪脂肪间充质干细胞特性的细胞系的方法，其包括如下步骤：将含有sv40lt基因构建的慢病毒载体转染哺乳动物细胞系，培养并获得sv40lt病毒液；用sv40lt病毒液感染分离的猪脂肪间充质干细胞。
5、具体地，所述哺乳动物细胞系为293t细胞。任选地，还包括对感染后的猪脂肪间充质干细胞进行形态观察和贴壁情况，以确定是否获得永生化猪脂肪间充质干细胞。
6、本专利技术进一步提供一种利用所述的细胞系或所述方法获得的细胞诱导诱导分化为脂肪细胞的方法。
7、具体地，将永生化猪脂肪间充质干细胞铺孔板无菌培养，加入诱导培养基，培养1-3天；再加入维持培养基，然后每1-3天更换一次，待细胞诱导至6-10天即可；
8、所述诱导培养基为dmem基础培养基+10％fbs+1％双抗+5mg/ml胰岛素+1μm地塞米松+1μm罗格列酮+0.5mm ibmx；所述维持培养基为dmem基础培养基+10％fbs+1％双抗+10mg/ml胰岛素+1μm罗格列酮。
9、在一个具体实施方式中，无菌培养条件是37℃、5％co2培养箱中无菌培养。
10、进一步包括对诱导后的细胞进行油红o染色，并观察脂滴染色情况，以确定是否分化成为成熟的脂肪细胞。
11、优选地，在诱导培养基添加厚朴酚以促进永生化猪脂肪间充质干细胞的分化，优选地厚朴酚添加量为10-30μm，更优选为18-22μm。
12、通过在原代猪脂肪间充质干细胞中稳定过表达sv40lt蛋白，成功得到了可以接近无限次传代的永生化的猪脂肪间充质干细胞，且永生化后猪脂肪间充质干细胞拥有和原代猪脂肪间充质干细胞相同的成脂分化的能力，并利用永生化的猪脂肪间充质干细胞成功筛选出可以促进猪脂肪间充质干细胞分化的小分子化合物厚朴酚。此专利技术为研究猪的脂肪代谢提供了一种更加便利的细胞系，使得体外药物筛选更加便利，有利于推动科研工作的进步。
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1.一种具有猪脂肪间充质干细胞特性的细胞系，其特征在于，其中导入并表达猴病毒40大T抗原的猪脂肪间充质干细胞系而建立。
2.如权利要求1所述的细胞系，其特征在于，所述导入并表达猴病毒40大T抗原是通过慢病毒质粒转导到猪脂肪间充质干细胞系中。
3.一种制备具有猪脂肪间充质干细胞特性的细胞系的方法，其包括如下步骤：
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞系为293T细胞。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，还包括对感染后的猪脂肪间充质干细胞进行形态观察和贴壁情况，以确定是否获得永生化猪脂肪间充质干细胞。
6.一种利用如权利要求1或2所述的细胞系，以及如权利要求3至5任一项所述方法获得的细胞诱导分化为脂肪细胞的方法。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将永生化猪脂肪间充质干细胞铺孔板无菌培养，加入诱导培养基，培养1-3天；再加入维持培养基，然后每1-3天更换一次，待细胞诱导至6-10天即可；
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，无菌培养条件是37℃、5% CO2培养
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，进一步包括对诱导后的细胞进行油红O染色，并观察脂滴染色情况，以确定是否分化成为成熟的脂肪细胞。
10.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，在诱导培养基添加厚朴酚以促进永生化猪脂肪间充质干细胞的分化，优选地厚朴酚添加量为10-30μM，更优选为18-22μM。
...【技术特征摘要】
1.一种具有猪脂肪间充质干细胞特性的细胞系，其特征在于，其中导入并表达猴病毒40大t抗原的猪脂肪间充质干细胞系而建立。
2.如权利要求1所述的细胞系，其特征在于，所述导入并表达猴病毒40大t抗原是通过慢病毒质粒转导到猪脂肪间充质干细胞系中。
3.一种制备具有猪脂肪间充质干细胞特性的细胞系的方法，其包括如下步骤：
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞系为293t细胞。
5.如权利要求3或4所述的方法，其特征在于，还包括对感染后的猪脂肪间充质干细胞进行形态观察和贴壁情况，以确定是否获得永生化猪脂肪间充质干细胞。
6.一种利用如权利要求1或2所述的细胞系，以及如权利要求3至5任一项所述方法...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈小冬，褚毅，桂思思，郑亚侦，赵亚湘，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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