【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
[相关申请的交叉引用]本申请基于2021年5月31日申请的日本专利申请号2021-091262的说明书(其公开内容整体通过参照引用至本说明书中)主张优先权。本专利技术涉及一种用于制作干细胞的细胞培养辅助剂以及使用细胞培养辅助剂制作干细胞的方法。
技术介绍
1、目前，作为由体细胞制作诱导性多能干细胞的方法，大致使用有两种技术。第一种技术涉及由山中氏所创造的诱导性多能干细胞ips细胞，它是在成纤维细胞中使用病毒载体使oct4、sox2、klf4、c-myc的转录因子蛋白质过表达并重编程的方法(非专利文献1)。第二种技术是最先由前川氏所报道的利用化合物进行的体细胞的直接重编程技术(非专利文献2、3、4)。ips细胞技术已经在再生医学领域、疾病脏器模型的药物研发应用中实现实用化，但避免免疫排异或由基因突变导致形成肿瘤的风险仍然是一大课题。此外，缩短从ips细胞建立至向目标脏器细胞重编程所需的时间以及降低成本也是重要的医疗课题。另一方面，化合物直接重编程技术无需担心基因突变导致形成肿瘤，仅通过患者自身的体细胞和化合物混合物即可实现脏器再生，因此有望在个体化再生医学中得到应用。然而，目前来看，能够通过本技术制作的脏器细胞类型仅限于神经细胞及脂肪细胞，开发制作方法是课题所在。
2、另外，近年来人们逐渐发现，癌症以被称为癌干细胞的极少数的细胞为起源而形成，作为增殖能力、分化功能不均匀的细胞群而形成肿瘤(非专利文献5)。与正常生物组织中存在的多能干细胞一样，癌干细胞也具有具备自我复制能力和产生各种细胞的分化能力的特点。一般认为，治疗癌
3、为了开发靶向癌干细胞的新药、新的治疗方法及诊断法，必须大量且稳定地制备作为模型的癌干细胞。为了用于高通量筛选、药理试验、安全性试验，癌干细胞的制作是不可或缺的。然而，技术上仍然存在较大瓶颈，只能依赖于从癌症患者样本中分离所检测到的极少量的癌干细胞的方法。
4、现有技术文献
5、非专利文献
6、非专利文献1：takahashi k,yamanaka s.induction of pluripotent stemcells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by definedfactors.cell 2006；126:663-676。
7、非专利文献2：maekawa m,yamaguchi k,nakamura t,shibukawa r,kodanaka i,ichsaka t,et al.direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternaltranscription factor glis1.nature 2011；474:225-229。
8、非专利文献3：yang z,ting z,hongkui d,et al.axen-like state bridgessomatic cells to pluripotency during chemical reprogramming.cell 2015；163:1678-1691。
9、非专利文献4：takeda y,harada y,yoshikawa t,dai p.chemical compound-based direct reprogramming for future clinical application.bioscience reports2018；38:1-19。
10、非专利文献5：reya t,morrison sj,clarke mf,et al.stem cells,cancer,andcancer stem cells,nature 2001；414:105-11。
技术实现思路
1、专利技术想要解决的问题
2、诱导性多能干细胞ips细胞使用病毒载体使sox2、oct4、klf4、c-myc等转录因子基因在成纤维细胞等的体细胞中强表达，因此，存在外部基因被整合于ips细胞的染色体并进而形成肿瘤的风险。另外，为了将成纤维细胞初始化，培养大量的ips细胞以将其分化诱导至目标脏器细胞并培养移植所需量，需要6个月到1年的时间以及大量的成本。
3、另外，普遍认为将多种化学合成物的混合物添加于培养液的直接重编程能够在60天左右的培养期间直接由体细胞制作多能干细胞。此外，由于使用小分子化合物，不存在外部基因整合于染色体的风险和形成肿瘤的风险。并且，通过使用来自患者的自体成纤维细胞，能够避免出现免疫排异的风险，有望在个体化再生医学中实现实用化。然而，能够通过本技术制作的脏器细胞类型仍然仅限于神经细胞或脂肪细胞，尚未在医疗、药物研发领域达到实用化。
4、另一方面，已知癌干细胞的存在会导致放射线治疗和化疗治疗的预后不佳，但尚未建立该细胞的分离法，无法进行医学研究。虽然尝试了从癌症患者样本中提取少量细胞，并通过细胞分选法从将癌症患者样本移植于免疫缺陷nod小鼠所制作的肿瘤块(pdox)中分离癌干细胞的方法或者添加bfgf、egf、pdgf等多种基因重组蛋白质因子或激素的培养法，当前尚未建立大量且稳定的方法。癌干细胞的使用对于候选药品的高通量筛选、药效评价、安全性评价是不可或缺的。
5、本专利技术的技术问题在于，提供一种来自体细胞的干细胞的新型制作方法。
6、用于解决问题的手段
7、为了解决上述问题，专利技术人等反复进行了潜心研究。并且，通过使用一种多肽针对细胞贴壁增殖进行了研究，该多肽具有仅pro-hyp-gly(构成i型胶原蛋白的氨基酸序列)的重复序列，结果发现：虽然是胶原蛋白的氨基酸序列的一部分，但与预想相反，细胞未贴壁于经该多肽包被的培养容器而是以悬浮状态凝聚而形成球体(spheroid，也有称“多细胞球体”或“细胞块”)。并且，还发现：通过将所述多肽的水溶液用作细胞培养辅助剂，能够将健康人成纤维细胞或乳腺上皮细胞等体细胞初始化(重编程)，从而制作具有分化能力的多能干细胞。另外，还发现：能够由普通的培养癌细胞株(不具有干细胞标记物的细胞)制作癌干细胞。
8、本专利技术是基于以上见解而完成的，是包括以下所示的多项技术方案的专利技术。
9、项1.一种细胞培养辅助剂，其包括由下列式(1)所示的多肽，
10、(pro-hyp-gly)n(1)
11、式中，hyp表示羟脯氨酸，n表示2～1000的整数。
12、项2.如项1所述的细胞培养辅助剂，其用于制造干细胞。
13、项3.如项2所述的细胞培养辅助剂，其中，所述干细胞是多潜能细胞或癌干细胞。
14、项4.如本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种细胞培养辅助剂，其包含由下列式(1)所示的多肽，
2.如权利要求1所述的细胞培养辅助剂，其用于制造干细胞。
3.如权利要求2所述的细胞培养辅助剂，其中，所述干细胞是多潜能细胞或癌干细胞。
4.如权利要求1所述的细胞培养辅助剂，其中，所述细胞培养辅助剂用于形成球体。
5.一种球体形成剂，其包含由下列式(1)所示的多肽，
6.一种细胞培养基材，其通过权利要求1至4中任一项所述的细胞培养辅助剂或者权利要求5所述的球体形成剂对培养面施加了表面处理而得到。
7.一种细胞培养体系，其包含权利要求1至4中任一项所述的细胞培养辅助剂或者权利要求5所述的球体形成剂及培养细胞。
8.一种干细胞的制造方法，其包括：
9.如权利要求8所述的制造方法，其中，
10.如权利要求8所述的制造方法，其中，所述干细胞是多能干细胞或癌干细胞。
11.一种组织的制造方法，其使用了通过权利要求8所述的方法得到的干细胞。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种细胞培养辅助剂，其包含由下列式(1)所示的多肽，
2.如权利要求1所述的细胞培养辅助剂，其用于制造干细胞。
3.如权利要求2所述的细胞培养辅助剂，其中，所述干细胞是多潜能细胞或癌干细胞。
4.如权利要求1所述的细胞培养辅助剂，其中，所述细胞培养辅助剂用于形成球体。
5.一种球体形成剂，其包含由下列式(1)所示的多肽，
6.一种细胞培养基材，其通过权利要求1至4中任一项所述的细胞培养辅助剂或...
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