多酶级联催化体系及其在对映-贝壳杉烯合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种多酶级联催化体系及其在对映‑贝壳杉烯合成中的应用，主要包括：1、级联催化体系设计：包含起始反应模块、前体合成级联反应和对映‑贝壳杉烯环化反应模块，确定了7个酶参与的级联体系。2、级联催化体系组装：以纯酶为催化剂，筛选了合适的底物浓度和缓冲剂配方，确定了级联反应途径酶的最佳工作浓度。3、级联催化体系优化：对催化起始反应的人工酶进行改造，实现对对映‑贝壳杉烯的高效合成，本发明专利技术从低成本烯醇出发合成对映‑贝壳杉烯的多酶级联催化体系，实现对其以37 mg·L<supgt;‑1</supgt;·h<supgt;‑1</supgt;的速率高效合成。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及合成生物学以及酶工程领域，尤其涉及一种多酶级联催化体系及其制备对映-贝壳杉烯化合物的方法。

技术介绍

1、目前，在生物体内构建异源生物合成途径是对萜类天然产物最简单高效的合成方式之一。萜类天然产物是自然界中种类最多、结构最复杂的天然产物之一，其生物合成都是起始于两种基本的五碳异戊二烯单元[1]：二甲基烯丙基焦磷酸(dmapp)和异戊烯基焦磷酸(ipp)，ipp/dmapp可直接在相应的异戊烯基转移酶或萜类环化酶的作用下合成萜类天然产物。ipp/dmapp在自然界中主要来源于甲羟戊酸(mva)途径或者2-甲基赤藓醇磷酸(mep)途径。mep途径起源于丙酮酸和(d)-甘油醛-3-磷酸，mva途径以中心代谢物乙酰辅酶a为起始底物，这两种途径分别在经过数个不同酶的催化后形成ipp/dmapp。尽管mva和mep途径作为经典的ipp/dmapp合成途径已经被广泛的运用于许多萜类的生产，但其在异源生物合成的应用过程中，仍然存在一些难以克服的挑战，如：前体ipp的积累对细胞存在抑制作用；内源初生代谢途径与异源生物合成途径存在竞争关系；异源生物合成的途径产物本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种合成对映-贝壳杉烯的多酶级联催化反应体系，其特征在于，所述多酶级联催化反应体系由三个模块构成，分别是合成IPP/DMAPP的起始反应模块、前体合成级联反应模块以及对映-贝壳杉烯环化反应模块；所述的多酶级联催化反应体系的优化涉及到一种EcThiM突变体；

2.根据权利要求1所述一种合成对映-贝壳杉烯的多酶级联催化反应体系，其特征在于，所述多酶级联催化反应体系的缓冲剂配方为：100mM HEPES pH 7.6,100mM KCl,10mMMgCl2,2mM MnCl2,5mM DTT,0.1％BSA,0.025％Tween-20。

3.根据权利要求1所述一种...

【技术特征摘要】

1.一种合成对映-贝壳杉烯的多酶级联催化反应体系，其特征在于，所述多酶级联催化反应体系由三个模块构成，分别是合成ipp/dmapp的起始反应模块、前体合成级联反应模块以及对映-贝壳杉烯环化反应模块；所述的多酶级联催化反应体系的优化涉及到一种ecthim突变体；

2.根据权利要求1所述一种合成对映-贝壳杉烯的多酶级联催化反应体系，其特征在于，所述多酶级联催化反应体系的缓冲剂配方为：100mm hepes ph 7.6,100mm kcl,10mmmgcl2,2mm mncl2,5mm dtt,0.1％bsa,0.025％tween-20。

3.根据权利要求1所述一种合成对映-贝壳杉烯的多酶级联催化反应体系，其特征在于，所述多酶级联催化反应体系的底物浓度为：3-甲基-2-丁烯-1-醇(prenol)为2.5-20mm,3-甲基-3-丁烯-1-醇(isoprenol)为7.5-40mm,且atp为10-40mm。

4.根据权利要求1所述一种合成对映-贝壳杉烯的多酶级联催化反应体系，其特征在于，所述多酶级联催化反应体系中的酶浓度分别为：65μm ecthim,5-20μm mjipk，3-18μmerg20、7.5-45μm bts1，10-20μm ptmt2，20μm bjks和20μm ecidi。

【专利技术属性】
技术研发人员：项征，周梦婷，沙凤，张一彬，
申请(专利权)人：北京大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：

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