【技术实现步骤摘要】
本专利技术具体涉及一种同时测定猪可食性组织中钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己残留量的方法。
技术介绍
1、钩吻为马钱科植物胡蔓藤的全草，又名断肠草，野葛、毒根、大茶药等，味苦、微辛，性热,有大毒，主要分布在浙江、福建、广东、广西、湖南、贵州、云南等地。我国对于钩吻的应用历史十分悠久，《神农本草》记载钩吻“主金疮、乳痛、中恶风、咳逆上气，鬼”；民间因其毒性大，一直外用为主，能消肿拔毒、杀虫止痒；钩吻对人的毒性很大，据报道，人内服钩吻茎叶10g或根2～8g即能引起中毒。然而，小剂量的钩吻却对一些动物有促进生长的作用，如《唐本草》云“人或畜食其叶皆死,羊食则大肥,猪食之能治热性病”；《本草纲目》曾载：“人误食钩吻叶者致死，而羊食钩吻则大肥”；《广东中兽医常用草药》记载：“钩吻，常定期对猪羊服本药，可以健胃，杀虫，催肥”；《广西中药志》记载“当猪胃纳不良时，用以饲喂，能增进食欲”；由此可见，钩吻是一个相当有发展前景的，可开发为促进动物生长作用的中草药添加剂。
2、近年来，国内外对钩吻展开了深入进展，发现钩吻发挥药理作用的主要成分为钩吻生物碱；对钩吻生物碱进行了提取、分离、纯化及结构方面研究，发现钩吻生物总碱中含量最高的为钩吻素子，其次为钩吻素甲，接下来是钩吻素己，还含有胡蔓藤碱甲、乙、丙、丁等吲哚类生物碱。
3、为保障猪可食性组织(肌肉、肝脏和肾脏)的食用安全，同时促进中草药的开发和应用，以减少兽用抗生素的使用，进一步保障动物健康和食品安全，很有必要在猪生产和猪肉供应之间设置一道“安全屏障”，设定合理的休药期。公开号
4、目前尚未见到钩吻成分功能单体在猪可食性组织(肌肉、肝脏和肾脏)残留消除规律研究，也尚未见到利用内标物同时定量分析猪肌肉、猪肝脏和猪肾脏中痕量钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己的方法。
技术实现思路
1、基于现有技术的不足，本专利技术的目的是提供了一种同时测定猪可食性组织中钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己残留量的方法，利用固相萃取-超高液相色谱-质谱/质谱法进行测定，能用于同时定量分析猪肌肉、猪肝脏和猪肾脏中痕量钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己，该分析方法环境友好、快速、高效、灵敏。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
3、一种同时测定猪可食性组织中钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己残留量的方法，包括以下步骤：
4、(1)对照品溶液的制备
5、分别精确称取钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己和阿马碱标准物质，用甲醇溶解稀释，制得各单一对照品储备液，于-30～-15℃避光保存；然后量取钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己的单一对照品储备液，以含甲醇及甲酸的水溶液为对照品溶剂，经稀释混匀，制得不同浓度的混合对照品标准溶液；量取阿马碱的单一对照品储备液，用对照品溶剂稀释混匀，制得不同浓度的阿马碱对照品标准溶液；
6、(2)供试品溶液的制备
7、以猪可食性组织为样品、以含甲酸的乙腈溶液为提取溶剂，向样品中依次加入阿马碱溶液及提取溶剂，涡旋20～40s，于25～35℃超声处理25～35min，离心4～6min，得到一次提取液及残渣，向残渣中加入提取溶剂，重复涡旋、超声及离心处理，得到二次提取液，合并一次提取液及二次提取液后，离心4～6min后，得到澄清的提取物溶液；
8、于30±5℃，取提取物溶液在氮气流下吹干或者平行蒸干，得到固态提取物；以含甲醇及甲酸的水溶液为提取物溶剂，利用提取物溶剂将固态提取物溶解，涡旋20～40s，得到待净化液；
9、取待净化液装入活化后的固相萃取柱，以含甲醇及甲酸的水溶液为淋洗液，经淋洗、抽干后，再用甲醇进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液在氮气流下吹干，得到固态供试品；以含甲醇及甲酸的水溶液为供试品溶剂，利用供试品溶剂溶解固态供试品，经滤膜过滤，得到供试品溶液，装进样瓶中备用；
10、(3)样品中待测成分的测定
11、取步骤(1)制备得到的混合对照品标准溶液及阿马碱对照品标准溶液、步骤(2)制备得到的供试品溶液进样，利用多反应监测模式下的超高效液相色谱串联质谱法进行检测分析，通过下述公式计算中的钩吻素甲、钩吻素子、钩吻素己和阿马碱的含量进行定量；
12、公式：
13、x＝(a×ais×cs×v)/(as×ai×w)；
14、上式中：
15、x为待测的猪可食性组织样品中钩吻素的残留量，单位为μg/kg；
16、a为步骤(2)所述供试品溶液中钩吻素的峰面积；
17、as为步骤(1)所述混合对照品标准溶液中钩吻素的峰面积；
18、cs为步骤(1)所述混合对照品标准溶液中钩吻素的浓度，单位为μg/l；
19、ai为步骤(2)所述供试品溶液中添加的阿马碱的峰面积；
20、ais为步骤(1)所述阿马碱对照品标准溶液中阿马碱的峰面积；
21、v为步骤(2)所述供试品溶液的体积，单位为ml；
22、w为步骤(2)所述样品的质量，单位为g；
23、其中，所述钩吻素指代钩吻素甲、钩吻素子或钩吻素己，ai所对应的供试品溶液中阿马碱的浓度与ais所对应的阿马碱对照品标准溶液中阿马碱的浓度相同。
24、优选地，步骤(3)所述超高效液相色谱测定的条件为：色谱柱为xb-c18色谱柱，色谱柱温度为25～35℃，流动相由流动相a和流动相b组成，以体积浓度为0.05～0.15％甲酸的水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，进行梯度洗脱，流速为0.2～0.4ml/min。
25、进一步，所述色谱柱采用kinetex-xb-c18色谱柱，色谱柱的规格为100mm×2.1mm、孔径为100a、粒径2.6μm；所述梯度洗脱的程序为：
26、
27、优选地，所述质谱选用串联四级杆离子阱质谱仪，质谱测定的条件为：电喷雾离子源为esi，检测方式为mrm多反应监测，扫描模式为正离子模式，电喷雾电压为5000～6000v，离子源温度为450～550℃；雾化气压力为48～52psi，辅助气压力为53～57psi，气帘气压力为20～25psi，碰撞气压力为5～7psi，去簇电压为8～12v，去卷积电压为13～17v。
28、优本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时测定猪可食性组织中钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己残留量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述同时测定猪可食性组织中钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己残留量的方法，其特征在于，步骤(3)所述超高效液相色谱测定的条件为：色谱柱为XB-C18色谱柱，色谱柱温度为25～35℃，流动相由流动相A和流动相B组成，以体积浓度为0.05～0.15％甲酸的水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，流速为0.2～0.4mL/min。
3.根据权利要求2所述同时测定猪可食性组织中钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己残留量的方法，其特征在于：所述色谱柱采用Kinetex-XB-C18色谱柱，色谱柱的规格为100mm×2.1mm、孔径为100A、粒径2.6μm；所述梯度洗脱的程序为：
4.根据权利要求1所述同时测定猪可食性组织中钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己残留量的方法，其特征在于：所述质谱选用串联四级杆离子阱质谱仪，质谱测定的条件为：电喷雾离子源为ESI，检测方式为MRM多反应监测，扫描模式为正离子模式，电喷雾电压为5000～6000V，离子源温
5.根据权利要求1所述同时测定猪可食性组织中钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己残留量的方法，其特征在于：步骤(2)中所述阿马碱溶液的浓度为190～210μg/L，每克样品中阿马碱溶液的加入量为47.5～52.5μL。
6.根据权利要求5所述同时测定猪可食性组织中钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己残留量的方法，其特征在于：步骤(2)中所述含甲酸的乙腈溶液中甲酸的质量百分数为0.5～1.5％；制备提取物溶液时，提取溶剂的加入量以样品的质量计，每克样品对应每次提取溶剂的加入量为4.5～5.5mL。
7.根据权利要求6所述同时测定猪可食性组织中钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己残留量的方法，其特征在于：步骤(2)中所述超声的频率为95～105Hz，所述离心的转速为5500～6500rpm；制备待净化液时，提取物溶液所取的体积是提取物溶剂体积的1.8～2.2倍。
8.根据权利要求7所述同时测定猪可食性组织中钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己残留量的方法，其特征在于：步骤(2)中所述固相萃取柱采用HLB 3cc 60mg ExtractionCartridges SPE柱，该固相萃取柱采用3～4mL甲醇和3～4mL超纯水依次活化；取待净化液装入活化后的固相萃取柱时，待净化液的上样量为4.5～5.5mL。
9.根据权利要求8所述同时测定猪可食性组织中钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己残留量的方法，其特征在于：步骤(2)中所述淋洗时，淋洗液的用量以待净化液的上样体积计，每毫升待净化液对应淋洗液的用量为0.6～1mL；所述洗脱时，甲醇的用量以待净化液的上样体积计，每毫升待净化液对应淋洗液的用量为1～1.6mL。
10.根据权利要求1至9任一所述同时测定猪可食性组织中钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己残留量的方法，其特征在于：步骤(1)中所述对照品溶剂、步骤(2)所述提取物溶剂、供试品溶剂及淋洗液均是由甲醇与0.05～0.15％甲酸的水溶液按照体积比10:88～92混匀而成。
...【技术特征摘要】
1.一种同时测定猪可食性组织中钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己残留量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述同时测定猪可食性组织中钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己残留量的方法，其特征在于，步骤(3)所述超高效液相色谱测定的条件为：色谱柱为xb-c18色谱柱，色谱柱温度为25～35℃，流动相由流动相a和流动相b组成，以体积浓度为0.05～0.15％甲酸的水溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，进行梯度洗脱，流速为0.2～0.4ml/min。
3.根据权利要求2所述同时测定猪可食性组织中钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己残留量的方法，其特征在于：所述色谱柱采用kinetex-xb-c18色谱柱，色谱柱的规格为100mm×2.1mm、孔径为100a、粒径2.6μm；所述梯度洗脱的程序为：
4.根据权利要求1所述同时测定猪可食性组织中钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己残留量的方法，其特征在于：所述质谱选用串联四级杆离子阱质谱仪，质谱测定的条件为：电喷雾离子源为esi，检测方式为mrm多反应监测，扫描模式为正离子模式，电喷雾电压为5000～6000v，离子源温度为450～550℃；雾化气压力为48～52psi，辅助气压力为53～57psi，气帘气压力为20～25psi，碰撞气压力为5～7psi，去簇电压为8～12v，去卷积电压为13～17v。
5.根据权利要求1所述同时测定猪可食性组织中钩吻素甲、钩吻素子和钩吻素己残留量的方法，其特征在于：步骤(2)中所述阿马碱溶液的浓度为190～210μg/l，每克样品中阿马碱溶液的加入量为47.5～52.5μl。
6.根据权利要求5所述同时测定猪可...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨昆，邱荣超，胡佩佩，肖锐，曹俊杰，隆雪明，
申请(专利权)人：河南牧业经济学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。