【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于血液检测的，具体涉及一种同时测定全血中5′-磷酸吡哆醛、甜菜碱和甲基丙二酸含量的试剂盒及方法。
技术介绍
1、维生素b6由吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺，及其相应的5′-磷酸衍生物和降解产物吡哆酸组成，其中5′-磷酸吡哆醛为主要的生物活性形式，主要在碳水化合物和氨基酸代谢的酶促反应中起辅助因子的作用。甜菜碱是体内胆碱脂类在酶的作用下分解成游离胆碱再氧化而成，作为体内重要的甲基供体，在同型半胱氨酸的再甲基化反应中发挥重要作用。甲基丙二酸为维生素b12缺乏的早期标志物，维生素b12缺乏可引起高同型半胱氨酸血症，而维生素b6、甜菜碱等甲基供体相关营养素也可引起高同型半胱氨酸血症。
2、因此，需同时检测5′-磷酸吡哆醛、甜菜碱和甲基丙二酸，才能区分维生素b6缺乏、甜菜碱缺乏、还是维生素b12缺乏，并且相对于其他指标能更早诊断维生素b12缺乏症，还可为同型半胱氨酸血症提供诊断支持。
3、目前已报道的方法尚未能同时检测全血中5′-磷酸吡哆醛、甜菜碱和甲基丙二酸的含量。专利cn202210667367.3“检测水溶性维生素的方法和试剂盒”，其检测指标为5′-磷酸吡哆醛、甲基丙二酸、烟酰胺和叶酸等，但缺乏甜菜碱的检测，且检测样本为血清，但5′-磷酸吡哆醛大部分存在于红细胞，检测5′-磷酸吡哆醛应以全血为基质更具有代表性；专利cn202010723606.3“5-磷酸吡哆醛的检测方法”检测样本也是血清或者血浆。
4、目前甜菜碱的现有检测方法是以血清或者血浆为基质，但血清和血浆中稳定性较差，会随着样本保存时
5、对于全血样本，同时检测5′-磷酸吡哆醛、甜菜碱和甲基丙二酸，存在以下技术难题：甜菜碱在样本中的浓度会随保存时间升高，5′-磷酸吡哆醛在检测溶液中容易降解，影响检测结果的准确性，且甲基丙二酸与丁二酸为同分异构体，丁二酸在人体内含量也较高，其色谱、质谱行为和甲基丙二酸都非常相似，如何使二者达到基线分离，也是需要解决的技术问题之一。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术的首要目的在于提供一种同时测定全血中5′-磷酸吡哆醛、甜菜碱和甲基丙二酸含量的试剂盒。
2、本专利技术的另一目的在于提供使用上述试剂盒同时测定全血中5′-磷酸吡哆醛、甜菜碱和甲基丙二酸含量的方法，该方法灵敏度高、重现性好、准确度高、分析速度快，可为大样本的人群的疾病的预防、诊断及治疗提供依据。
3、本专利技术通过如下技术方案实现：
4、一方面，本专利技术提供了一种同时测定全血中5′-磷酸吡哆醛、甜菜碱和甲基丙二酸含量的试剂盒，包括：干血斑采血纸卡、干血斑提取液、同位素内标和高效液相色谱流动相；
5、所述干血斑提取液包括抗坏血酸20～60μg/ml、柠檬酸20～60μg/ml、氨水0.18～0.25％和二硫苏糖醇35～60mg/ml，优选所述二硫苏糖醇的质量浓度为40～45mg/ml。
6、所述同位素内标包括5′-磷酸吡哆醛-d3同位素内标、甜菜碱-d9同位素内标和甲基丙二酸-d3同位素内标；
7、所述高效液相色谱流动相是以(0.05-0.1)％甲酸-(0.5-2)mmol/l甲酸铵水溶液为流动相a，以(0.05-0.1)％甲酸乙腈溶液为流动相b。
8、另一方面，本专利技术还提供了上述试剂盒在同时测定全血中5′-磷酸吡哆醛、甜菜碱和甲基丙二酸含量中的应用。
9、再一方面，本专利技术提供了使用上述试剂盒同时测定全血中5′-磷酸吡哆醛、甜菜碱和甲基丙二酸含量的方法，包括如下步骤：
10、(1)采用干血斑采血纸卡采集全血制备干血斑样本；
11、(2)将干血斑样本放入离心过滤装置，加入干血斑提取液，涡旋提取，离心，即得供试品溶液；
12、(3)将供试品溶液调节ph值至酸性，通过高效液相色谱-质谱联用分析，采用内标法测定5′-磷酸吡哆醛、甜菜碱和甲基丙二酸的含量；
13、其中，所述高效液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以(0.05-0.1)％甲酸-(0.5-2)mmol/l甲酸铵水溶液为流动相a，以(0.05-0.1)％甲酸乙腈溶液为流动相b，梯度洗脱程序如下：
14、
15、
16、优选地，步骤(1)中，所述离心过滤装置为10-100kda，优选为30-50kda。
17、优选地，步骤(1)中，所述离心的方式为以1000r/min、2000r/min、4000r/min、10000r/min、12000r/min逐步提高转速，每个转速各离心2-3min。
18、优选地，步骤(1)中，所述提取液与干血斑的体积比为3-7：1。
19、优选地，步骤(2)中，所述色谱柱为phenomenex kinetex xb-c18 100×4.6mm 2.6μm。
20、优选地，步骤(2)中，以0.1％甲酸-1mmol/l甲酸铵水溶液为流动相a，以0.1％甲酸乙腈溶液为流动相b。
21、优选地，步骤(2)中，将供试品溶液调节ph值至酸性所采用的酸溶液可以为4％甲酸水溶液。
22、优选地，步骤(2)中，流速为0.3-0.8ml/min；柱温为25-45℃。
23、优选地，步骤(2)中，所述质谱条件为：电离方式：电喷雾正负离子模式；检测方式：多反应检测mrm；气帘气压力：25～40psi；离子喷雾电压：5000～5500v和-4000～-4500v；温度：450～600℃；雾化气：40～70psi；辅助加热气：40～70psi。
24、本专利技术与现有技术相比，具有如下优异效果：
25、本专利技术方法通过样本基质的优化，采用干血斑采血纸卡采集全血制备干血斑样本，解决了甜菜碱在样本中的浓度会随保存时间升高的问题；通过优选合适的提取液，提高了5′-磷酸吡哆醛的稳定性；并通过色谱条件的优化，使互为异构体的甲基丙二酸与丁二酸达到了较好的基线分离，保证了检测结果的准确度。
26、本专利技术基于干血斑技术，通过采用高效液相色谱-质谱联用建立了一种能同时测定全血中5′-磷酸吡哆醛、甜菜碱和甲基丙二酸含量的方法，该方法灵敏度高、重现性好、准确度高、分析速度快，且省去了繁琐的检测前处理步骤，检测成本低，可为大样本的人群的疾病的预防、诊断及治疗提供依据。
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1.一种同时测定全血中5'-磷酸吡哆醛、甜菜碱和甲基丙二酸含量的试剂盒，其特征在于，包括：干血斑采血纸卡、干血斑提取液、同位素内标和高效液相色谱流动相；
2.权利要求1所述的试剂盒在同时测定全血中5'-磷酸吡哆醛、甜菜碱和甲基丙二酸含量中的应用。
3.一种使用权利要求1所述的试剂盒同时测定全血中5'-磷酸吡哆醛、甜菜碱和甲基丙二酸含量的方法，其特征在，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中， 所述离心过滤装置为10-100kDa，优选为30-50kDa。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述离心的方式为以1000r/min、2000r/min、4000r/min、10000r/min、12000r/min逐步提高转速，每个转速各离心2-3min。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述干血斑提取液与干血斑的体积比为3-7：1。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述色谱柱为PhenomenexKinetex X
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，以0.1%甲酸-1mmol/L甲酸铵水溶液为流动相A，以0.1%甲酸乙腈溶液为流动相B。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，流速为0.3-0.8 mL/min；柱温为25-45 ℃。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述质谱条件为：电离方式：电喷雾正负离子模式；检测方式：多反应检测MRM；气帘气压力：25~40 psi；离子喷雾电压：5000 ~ 5500V和-4000 ~ -4500V；温度：450~600℃；雾化气：40~70 psi；辅助加热气：40~70psi。
...【技术特征摘要】
1.一种同时测定全血中5'-磷酸吡哆醛、甜菜碱和甲基丙二酸含量的试剂盒，其特征在于，包括：干血斑采血纸卡、干血斑提取液、同位素内标和高效液相色谱流动相；
2.权利要求1所述的试剂盒在同时测定全血中5'-磷酸吡哆醛、甜菜碱和甲基丙二酸含量中的应用。
3.一种使用权利要求1所述的试剂盒同时测定全血中5'-磷酸吡哆醛、甜菜碱和甲基丙二酸含量的方法，其特征在，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中， 所述离心过滤装置为10-100kda，优选为30-50kda。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述离心的方式为以1000r/min、2000r/min、4000r/min、10000r/min、12000r/min逐步提高转速，每个转速各离心2-3min。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，...
【专利技术属性】
技术研发人员：苏昭仑，范鹏飞，汪玉芳，黄正华，贺瑞坤，
申请(专利权)人：汤臣倍健股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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