【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于纳米药物制剂及核酸疫苗，更具体的说是涉及一种治疗黑色素瘤及其肺转移的mrna疫苗制剂及其制备方法和应用。
技术介绍
1、肿瘤高的侵袭性及后期的转移性已严重威胁人类健康，随着新型治疗方式的出现，肿瘤免疫治疗已成为一种有潜力的新型治疗策略，与传统的化疗及手术治疗方式不同，肿瘤免疫治疗方式是通过刺激机体的免疫系统产生强效的免疫效力来杀伤肿瘤细胞，并不会对正常细胞产生较大的影响，在这其中，肿瘤疫苗通过递送肿瘤相关抗原或特异性抗原进入机体组织，诱导抗原提呈细胞成熟，经mhc类分子和t细胞相互作用，产生有效的抗肿瘤免疫效应。与多肽/蛋白疫苗相比，信使rna(mrna)疫苗具有更强的有效性，更高的安全性，并且具备快速量产的可能性，因此，mrna疫苗有望成为治疗肿瘤的有效免疫策略。mrna疫苗通过向体内递送特定抗原的mrna序列，并在胞质中翻译为蛋白质，激活机体的免疫系统来达到免疫治疗的目的。但mrna疫苗在存在良好前景的同时，也存在一些障碍，例如在体内多种酶的作用下，mrna极不稳定，易被核酸酶讲解。且自身所携带的负电荷使得递送效率较为低下，需要寻求合适的递送载体提高mrna的递送效率并有效保护mrna被酶的降解。纳米载体技术可作为有效的策略来解决mrna递送难题。
2、肿瘤微环境中nk细胞的浸润程度与肿瘤细胞的状态密切相关。mrna疫苗所诱导的适应性免疫应答能力也依赖于先天免疫应答能力的增强，而肿瘤微环境中nk细胞的数量较少削弱了适应性免疫应答的效力。nk细胞源于骨髓中造血干细胞，由nk前体细胞分化而来，因其具有m
3、作为一种生物相容性载体，脂质纳米粒的核心空腔可作为包载mrna的有效部位，脂质纳米粒的生物膜样的结构易于和受体细胞结合，达到更高的转染效果，并可在体内安全降解。阳离子脂质体可更好的负载带负电的核酸药物，兼具载体和佐剂功能，可诱导较强的体液免疫和细胞免疫效力。嘎德莫特作为一种咪唑啉类似物，将其包载于阳离子脂质体中，可经tlr7受体可调节nk细胞的比例，可刺激nk细胞增殖，激活固有免疫辅助细胞免疫应答策略。
4、黑色素瘤在病程晚期，癌细胞大量扩散，经血管或淋巴管通过血液系统向全身多器官进行转移，常见于肺部的转移，可引起咳嗽咳血等严重症状，严重危害人类的健康，针对黑色素瘤及肺转移的后果，采用肿瘤疫苗治疗的策略在于提升适应性免疫应答的同时，也能增强固有免疫应答能力，通过改善dc细胞，cd8+t细胞，nk细胞的比例来杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的增值及转移。
5、综上所述，如何构建一种治疗黑色素瘤及其肺转移的mrna疫苗是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种治疗黑色素瘤及其肺转移的mrna疫苗制剂及其制备方法和应用。
2、所述的治疗黑色素瘤及其肺转移的mrna疫苗制剂可利用脂质体复合物共包载抗原特异性mrna及嘎德莫特，mrna翻译为蛋白后，经树突状细胞表面mhc分子递送，活化t细胞介导的免疫应答；嘎德莫特通过tlr7在改善cd8+t细胞的同时，可增强nk细胞的比例，通过交叉激活先天免疫和适应性免疫应答过程，抑制黑色素瘤增值及肺部转移。
3、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
4、本专利技术第一技术目的是提供一种治疗黑色素瘤及其肺转移的mrna疫苗制剂，所述治疗黑色素瘤及其肺转移的mrna疫苗制剂是由负载嘎德莫特的阳离子脂质体复合物、鱼精蛋白和mrna构成；其中，
5、所述负载嘎德莫特的阳离子脂质体复合物为嘎德莫特吸附于阳离子脂质体上；
6、所述嘎德莫特和mrna分别占所述mrna疫苗制剂质量的1.5％～5％和10～20％；
7、具体地，所述嘎德莫特通过自组装方式吸附于阳离子脂质体的磷脂层，以形成所述负载嘎德莫特的阳离子脂质体复合物；所述负载嘎德莫特的阳离子脂质体复合物携带的表面电荷通过静电吸附力包裹鱼精蛋白-mrna缩合物；所述鱼精蛋白-mrna缩合物是由鱼精蛋白与mrna按照质量比0.5:1-7:1缩合而得。
8、该疫苗可实现嘎德莫特与mrna的共包载，协同发挥抗肿瘤作用，其中嘎德莫特可激动tlr7受体，上调nk细胞的数量；mrna可翻译为蛋白，经树突状细胞表面分子mhc分子的呈递，诱导活化t细胞免疫效应，协同增强机体先天免疫和适应性免疫能力，用于黑色素瘤及其后期肺转移的治疗。
9、该疫苗可通过toll样受体信号通路、细胞毒性t淋巴细胞信号通路、jak-stat信号通路、趋化因子信号通路、自然杀伤细胞介导的先天免疫应答等通路发挥抗肿瘤作用，抑制黑色素瘤经典致病途径抑制黑色素瘤增值及其肺转移过程，直接杀伤肿瘤细胞；
10、优选的，通过tlr7受体激活、cd8+t、jak2-stat1、cxcl4l1趋化因子、nk细胞活化等抑制黑色素瘤经典致病途径来杀伤肿瘤。
11、优选的，所述治疗黑色素瘤及其肺转移的mrna疫苗制剂的粒径为100～500nm，zeta电位为+10～+25mv，包封率为80～96％，mrna的载药量为9.5～18％。
12、进一步地，所述mrna为肿瘤抗原相关mrna，包括肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原；具体地所述mrna为黑色素瘤抗原a1、酪氨酸酶相关蛋白抗原trp-2或癌胚抗原、黑色素瘤分化抗原gp-100；所述mrna优选黑色素瘤分化抗原gp-100，其理论长度为2130nt，在黑色素瘤纤维组织中高表达；所述嘎德莫特为靶向tlr7的咪唑啉类似物，分子量为313.39742，可包载阳离子脂质体中发挥作用。
13、更进一步地，所述阳离子脂质体由磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000按照摩尔比2:1:1:0.15～3:2:1:0.4组成；所述阳离子脂质体与嘎德莫特的质量比为25:1～50:1；
14、所述磷脂为1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷氯盐、溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵、4-(n,n-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯中的一种或几种组合。
15、本专利技术第二技术目的是提供一种治疗黑色素瘤及其肺转移的mrna疫苗制剂的制备方法，所述制备方法采用薄膜分散法，具体操作步骤如下：
16、1)将嘎德莫特和阳离子脂质体溶于有机溶剂，经过减压旋转蒸发形成脂质薄膜，使用氮气除去有机溶剂，之后加入水化介质，在35～55℃水浴环境下水化孵育5～30min，得到负载嘎德莫特的阳离子脂质体复合物；
17、2)将鱼精蛋白与mrna按照0.5:1-7:1比例混匀缩合，得到鱼精蛋白-mrna缩合物；
18、3)将步骤2)制备的鱼精蛋白-本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种治疗黑色素瘤及其肺转移的mRNA疫苗制剂，其特征在于，所述治疗黑色素瘤及其肺转移的mRNA疫苗制剂是由负载嘎德莫特的阳离子脂质体复合物、鱼精蛋白和mRNA构成；其中，
2.根据权利要求1所述的一种治疗黑色素瘤及其肺转移的mRNA疫苗制剂，其特征在于，所述治疗黑色素瘤及其肺转移的mRNA疫苗制剂的粒径为100～500nm，Zeta电位为+10～+25mV，包封率为80～96％，mRNA的载药量为9.5～18％。
3.根据权利要求1或2所述的一种治疗黑色素瘤及其肺转移的mRNA疫苗制剂，其特征在于，所述mRNA为黑色素瘤抗原A1、酪氨酸酶相关蛋白抗原TRP-2或癌胚抗原、黑色素瘤分化抗原gp-100。
4.根据权利要求3所述的一种治疗黑色素瘤及其肺转移的mRNA疫苗制剂，其特征在于，所述阳离子脂质体由磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000按照摩尔比2:1:1:0.15～3:2:1:0.4组成；所述阳离子脂质体与嘎德莫特的质量比为25:1～50:1。
5.根据权利要求4所述的一种治疗黑色素瘤及其肺转移的mRNA疫苗
6.一种如权利要求1所述的治疗黑色素瘤及其肺转移的mRNA疫苗制剂制备方法，其特征在于，采用薄膜分散法制备所述治疗黑色素瘤及其肺转移的mRNA疫苗制剂，具体操作步骤如下：
7.根据权利要求6所述的一种治疗黑色素瘤及其肺转移的mRNA疫苗制剂的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为氯仿-甲醇、乙醚、乙醇、石油醚中的一种或几种组合；
8.一种如权利要求1所述的治疗黑色素瘤及其肺转移的mRNA疫苗制剂在提高免疫效应的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疫苗制剂的免疫通过皮下注射、肌肉注射或鼻粘膜途径给药，免疫治疗3次，每次免疫治疗间隔3-5天。
...【技术特征摘要】
1.一种治疗黑色素瘤及其肺转移的mrna疫苗制剂，其特征在于，所述治疗黑色素瘤及其肺转移的mrna疫苗制剂是由负载嘎德莫特的阳离子脂质体复合物、鱼精蛋白和mrna构成；其中，
2.根据权利要求1所述的一种治疗黑色素瘤及其肺转移的mrna疫苗制剂，其特征在于，所述治疗黑色素瘤及其肺转移的mrna疫苗制剂的粒径为100～500nm，zeta电位为+10～+25mv，包封率为80～96％，mrna的载药量为9.5～18％。
3.根据权利要求1或2所述的一种治疗黑色素瘤及其肺转移的mrna疫苗制剂，其特征在于，所述mrna为黑色素瘤抗原a1、酪氨酸酶相关蛋白抗原trp-2或癌胚抗原、黑色素瘤分化抗原gp-100。
4.根据权利要求3所述的一种治疗黑色素瘤及其肺转移的mrna疫苗制剂，其特征在于，所述阳离子脂质体由磷脂、胆固醇、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000按照摩尔比2:1:1:0.15～3:2:1:0.4组成；所述阳离子脂质体与嘎德莫特的质...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨建宏，李小龙，左文宝，郭珏铄，买亚萍，马朋龙，蒙停停，
申请(专利权)人：宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：
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