【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，属于化妆品原料性能测试。
技术介绍
1、皮肤老化是机体衰老的一部分，是一个复杂的生物学过程，一般可分为自然老化和光老化。自然老化发生在所有的组织，包括遗传、新陈代谢和时间流逝等多种因素，是一种不可避免的现象。自然老化的皮肤呈现消瘦、细纹和干燥的现象，而光老化皮肤通常表现为表皮增厚、出现皱纹、松弛、暗沉和粗糙等现象。
2、无论是自然老化，还是光老化，都与ros的过量产生密切相关。ros过量产生会引发细胞氧化应激，而氧化应激对核酸、蛋白质和脂质造成氧化损伤并促进皮肤老化。非酶糖基化学说、羰基毒化学说和自由基—美拉德反应学说都提出了一种分子水平的衰老现象,即蛋白分子上的氨基与糖分子上的羰基反应生成糖基化蛋白，ages的生成带来的组织结构的老化难于修复,不可逆转,最终胶原蛋白交联,皮肤失去弹性,脂褐素逐渐聚积,皮肤颜色逐渐暗沉,产生老年斑。真皮层中，游离的胶原肽可以与透明质酸一起增强保湿性能，形成网状结构的胶原蛋白是细胞、神经、血管的支架，同时赋予皮肤的弹性，使皮肤饱满。25岁以后，成纤维细胞产生胶原蛋白的速度越来越慢，交联的、降解流失的胶原蛋白越来越多，导致皮肤中胶原蛋白越来越少，最终形成皱纹，皮肤松弛。紫外线、自由基、糖基化是促使胶原蛋白交联反应的主要因素,防紫外线、抗氧化、抗糖基化是减缓真皮层胶原蛋白交联的主要措施。
3、自然界中皮肤老化的三种重要诱因是自由基因素、紫外线因素和糖基化因素。现有技术中未见综合三种因素综合评估原料在皮肤抗衰中表
技术实现思路
1、本专利技术的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，针对自然老化和光老化，构建了以人原代成纤维细胞为研究对象的三种模拟衰老的细胞模型，这三种模拟衰老的细胞模型分别用h2o2、uva、ages作为造模材料，模拟自然界中皮肤老化的三种重要诱因：自由基因素、紫外线因素和糖基化因素，综合评估目标原料在真皮通路的抗衰老性能，属于系统型评估方法，具有快速、高效、准确的优势。
2、实现上述目的的技术方案是：一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，结合三种衰老细胞模型的检测结果，对目标原料的抗衰老活性进行筛选，包括以下步骤：
3、s1，评估原料样品的溶解性，确定溶解方案；
4、s2，成纤维细胞的培养；
5、s3，细胞活性检测确定原料样品检测浓度，包括以下工序：
6、s31，取步骤s2中对数生长的成纤维细胞接种培养16h～24h，加入实验样品，所述实验样品包含若干个不同浓度梯度原料样品，对照样品为不添加任何样品的培养基溶液，培养16h～24h，加入cck-8或者mtt检测吸光度，计算细胞存活率；
7、s32，步骤s31筛选得到成纤维细胞模型细胞存活率为90％(cv90)时对应的原料样品给药浓度；
8、s4，取步骤s2中对数生长的成纤维细胞接种培养16h～24h，设置空白对照组，h2o2组及样本组，其中，空白对照组加入完全培养基，h2o2组和样品组加入由完全培养基配置的h2o2溶液孵育2h，用pbs清洗后更换为完全培养基，样品组加入步骤s32中cv90对应给药浓度的原料样品，培养22h～24h后，收集细胞上清液分别检测细胞上清液分泌i型前胶原蛋白(pc-1)和iii型胶原蛋白(col-3)的含量；
9、s5，取步骤s2中对数生长的成纤维细胞接种培养16h～24h，设置空白对照组，uva照射组及样本组，其中，空白对照组加入完全培养基，uva照射组和样品组更换为ebss缓冲液放入uva中照射，结束后洗去缓冲液更换为完全培养基，样品组加入步骤s32中cv90对应给药浓度的原料样品，培养4h后，收集细胞提取rna，检测iii型胶原蛋白(col-3)的mrna表达量；
10、s6，取步骤s2中对数生长的成纤维细胞接种培养16h～24h，设置空白对照组，ages组及样本组，其中，空白对照组加入完全培养基，ages组加入由完全培养基配置的ages溶液，样品组同时加入由ages和步骤s32中cv90对应给药浓度的原料样品组成的溶液，孵育48h，收集各组细胞检测细胞中ros荧光强度及细胞凋亡率；
11、s7，汇总步骤s4～s6中测定结果，计算检测各样本组与相应的造模组检测量比值，得到相对表达量，所述造模组为h2o2组、uva照射组和ages组；然后应用graphpad prism作图，结果表示为mean±sd；各组间比较采用one-way anova统计分析；所有的统计分析均为双尾；
12、p<0.05认为具有显著差异，用“*”表示，说明该原料样品具有一定抑制作用，评分为0.3；
13、p<0.01认为具有非常显著差异，用“**”表示，说明该原料样品具有显著抑制作用，评分为0.7；
14、p<0.001认为具有极其显著差异，用“***”表示，说明该原料样品具有极其显著抑制作用，评分为1.0；
15、根据上述评分标准汇总所有检测指标评分，由此筛选出具有最佳抗衰老功效的原料样品。
16、上述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，步骤s4中，i型前胶原蛋白(pc-1)和iii型胶原蛋白(col-3)的含量中至少一种构成细胞h2o2衰老模型评价指标；步骤s5中，iii型胶原蛋白(col-3)的mrna表达量构成细胞uva衰老模型维度评价指标；步骤s6中，ros荧光强度及细胞凋亡率中至少一种构成细胞ages糖基化衰老模型评价指标。
17、上述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，步骤s1中，水中溶解度≥1000μg/ml的原料样品直接溶于培养基进行后续实验；
18、水中溶解度＜1000μg/ml的原料样品用二甲基亚砜溶解后进行后续实验。
19、上述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，其中，使用二甲基亚砜作为溶剂时，溶剂的体积百分比浓度不得超过总体积的1％，且对照样品和实验样品中溶剂的体积比例相同。
20、上述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，步骤s2中，成纤维细胞采用人成纤维细胞完全培养基培养，培养条件为37±0.5℃，(5±1)％co2浓度，饱和湿度。
21、上述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，步骤s31中，成纤维细胞以(0.5-2.0)x105个细胞/ml的密度接种于96孔板中，每孔培养基100ul，每种待测原料样品配置5～8个浓度梯度，每个浓度设3个及以上复孔。
22、上述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，步骤s4中，成纤维细胞以(1-2.5)x104个细胞/ml的密度接种于24孔板中，每孔培养基1000ul，加入本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，其特征在于，结合三种衰老细胞模型的检测结果，对目标原料的抗衰老活性进行筛选，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，其特征在于，步骤S4中，I型前胶原蛋白和III型胶原蛋白的含量中至少一种构成细胞H2O2衰老模型评价指标；步骤S5中，III型胶原蛋白的mRNA表达量构成细胞UVA衰老模型维度评价指标；步骤S6中，ROS荧光强度及细胞凋亡率中至少一种构成细胞AGEs糖基化衰老模型评价指标。
3.根据权利要求1所述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，其特征在于，步骤S1中，水中溶解度≥1000μg/mL的原料样品直接溶于培养基进行后续实验；
4.根据权利要求3所述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，其特征在于，使用二甲基亚砜作为溶剂时，溶剂的体积百分比浓度不得超过总体积的1％，且对照样品和实验样品中溶剂的体积比例相同。
5.根据权利要求1所述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功
6.根据权利要求1所述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，其特征在于，步骤S31中，成纤维细胞以(0.5-2.0)x105个细胞/mL的密度接种于96孔板中，每孔培养基100uL，每种待测原料样品配置5～8个浓度梯度，每个浓度设3个及以上复孔。
7.根据权利要求1所述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，其特征在于，步骤S4中，成纤维细胞以(1-2.5)x104个细胞/mL的密度接种于24孔板中，每孔培养基1000uL，加入H2O2最终浓度200μmol/mL，每种原料样品设3个及以上复孔。
8.根据权利要求1所述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，其特征在于，步骤S5中，成纤维细胞以7.5x104个细胞/mL的密度接种于6孔板中，每孔培养基2000uL，UVA的辐照剂量为5-20J/cm2，每种原料样品设3个及以上复孔。
9.根据权利要求1所述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，其特征在于，步骤S6中，成纤维细胞以1.5x104个细胞/mL的密度接种于24孔板中，每孔培养基1000uL，加入AGEs最终浓度500μg/mL，每种原料样品设3个及以上复孔。
10.根据权利要求1所述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，其特征在于，步骤S4～S6中，I型前胶原蛋白的含量、III型胶原蛋白的含量和ROS荧光强度分别采用ELISA试剂盒检测；III型胶原蛋白的mRNA表达量采用q-PCR法检测；细胞凋亡率采用Annexin V-FITC/PIApoptosis Kit试剂盒染色后在流式细胞仪上机检测。
...【技术特征摘要】
1.一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，其特征在于，结合三种衰老细胞模型的检测结果，对目标原料的抗衰老活性进行筛选，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，其特征在于，步骤s4中，i型前胶原蛋白和iii型胶原蛋白的含量中至少一种构成细胞h2o2衰老模型评价指标；步骤s5中，iii型胶原蛋白的mrna表达量构成细胞uva衰老模型维度评价指标；步骤s6中，ros荧光强度及细胞凋亡率中至少一种构成细胞ages糖基化衰老模型评价指标。
3.根据权利要求1所述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，其特征在于，步骤s1中，水中溶解度≥1000μg/ml的原料样品直接溶于培养基进行后续实验；
4.根据权利要求3所述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，其特征在于，使用二甲基亚砜作为溶剂时，溶剂的体积百分比浓度不得超过总体积的1％，且对照样品和实验样品中溶剂的体积比例相同。
5.根据权利要求1所述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，其特征在于，步骤s2中，成纤维细胞采用人成纤维细胞完全培养基培养，培养条件为37±0.5℃，(5±1)％co2浓度，饱和湿度。
6.根据权利要求1所述的一种利用原代成纤维细胞评估化妆品原料抗衰老功效的方法，其特征在于，步骤s31中，成纤维细胞以(0.5-2.0)x105个细胞/ml的密...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘瑾，王博，卞燕南，王飞飞，马骁，郭振宇，
申请(专利权)人：云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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