【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，涉及一种clcn6基因点突变小鼠动物模型的构建方法及应用。
技术介绍
1、电压门控氯离子通道和氯转运体(voltage-gated chloride channel andtransporter，clc)家族有9个成员，分为氯离子通道和氯转运体两大类。其中clcn1、clcn2、clcnka、clcnkb编码的cic-1、cic-2、cic-ka、cic-kb为细胞膜上的氯离子通道，在电兴奋性、胞内外离子稳态、跨上皮转运等方面发挥作用；clcn3至clcn7编码的clc-3至clc-7为内体/溶酶体膜上的2cl-/h+反向转运体，主要影响囊泡离子组成、内吞作用及溶酶体功能。随着clc家族模型动物的研究进展和病人中不断鉴定出clc家族成员基因致病性变异，其与疾病的关系逐渐被发现。除了主要在肾脏表达的clc-5，其他定位于内体/溶酶体上的2cl-/h+反向转运体功能障碍均可导致严重神经系统疾病，比如clcn4基因突变可导致人类出现智力障碍和癫痫表型，clcn6基因突变可引起人类早发性神经退行性疾病，以及clcn7基因突变引起人类和小鼠溶酶体贮积病。
2、clc-6是晚期内体膜上的2cl-/h+交换体，特异性的表达于神经系统，其将cl-从细胞质逆浓度梯度转运到晚期内体，同时将h+由晚期内体转运至细胞质。内体、溶酶体的酸化主要由其膜上的囊泡型质子泵(vacuolar h+-adenosine triphosphatase，v-atpase)完成。clc-6向晚期内体腔内转运带负电荷的cl-可以中和
3、近年来crispr/cas9技术获得了快速发展。该技术是基于对细菌和古细菌中的免疫系统改造而建立，通过sgrna介导核酸内切酶cas9蛋白进行目标dna序列识别并造成dna双链断裂，促进以同源重组或非同源末端连接方式修复受损dna，从而对目标位点实现基因的定点敲除、敲入以及基因修正等多种修饰。使用crispr/cas9技术进行基因编辑需要两个关键因素，首先是有效的sgrna引导序列，再就是cas9蛋白的存在。与锌指核酸酶(zfn)技术和类转录样效应因子核酸酶(talen)技术相比，因其靶向编辑目标基因的特异性、高效性和设计的简便性等诸多优点得到越来越广泛的应用，在细菌、哺乳动物细胞以及斑马鱼、小鼠、大鼠等都表现出很强的基因组编辑活性。
4、因此,建立特异性高，分子构建简单，流程短的crispr/cas9基因编辑技术构建clcn6基因点突变小鼠动物模型及其应用，具有十分重要的社会意义和经济价值。
技术实现思路
1、本专利技术旨在基于crispr/cas9技术提供一种clcn6基因点突变小鼠动物模型的构建方法及应用；本专利技术利用crispr/cas9技术，通过同源重组的原理，对靶位点进行基因修饰。具体过程如下：设计并体外转录grna,同时构建同源重组载体(donor vector)；将cas9,grna,donor vector同时注射到小鼠的受精卵中；cas9蛋白在grna引导下结合到靶位点进而造成dna双链断裂，donor vector通过同源重组修复断裂的双链，从而实现对靶位点的基因修饰。获得了全球首个携带病人变异的clcn6(clcn6的同源基因)基因点突变小鼠(clcn6e200a/+)模型，为进一步研究clcn6的功能奠定了良好的基础。
2、为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：
3、第一方面，本专利技术涉及一种clcn6基因点突变小鼠动物模型的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
4、步骤一，设计并体外转录grna，同时构建同源重组载体donor vector，通过胚胎显微注射移植法将cas9、grna、donor vector同时注射到c57bl/6j野生型小鼠的受精卵中，获得clcn6基因点突变clcn6e200a/+小鼠；
5、步骤二，对clcn6基因点突变小鼠动物模型进行基因型鉴定。
6、优选的，步骤一包括以下步骤：
7、s11，设计并体外转录grna，同时构建同源重组载体donor vector；
8、s12，通过胚胎显微注射移植法将cas9、grna、donor vector同时注射到c57bl/6j野生型小鼠的受精卵中；
9、s13，经胚胎移植，获得f0小鼠，通过pcr，测序确认，共获得如下同源重组的阳性f0代小鼠；
10、s14，将得到的阳性f0代雄性小鼠分别与野生型雌性小鼠进行交配，获得阳性f1代小鼠，或者将f0代雄性小鼠的精子与c57bl/6j野生型小鼠卵母细胞进行体外受精并移植入假孕母鼠体内，获得阳性f1代小鼠，通过pcr和dna测序筛选出clcn6基因点突变小鼠动物模型。
11、优选的，步骤二包括以下步骤：
12、s21，提取f0代小鼠尾部dna，经pcr和dna测序确认；
13、s22，提取f1代小鼠尾部dna，根据鉴定策略示意图，经pcr和dna测序确认。
14、所述鉴定策略示意图如图2所示。
15、其中，野生型：测序结果仅存在wildtype序列；杂合子：测序结果同时存在wildtype&mutation序列；纯合子：测序结果仅存在mutation序列。
16、优选的，所述pcr扩增采用clcn6-seq-f1与clcn6-seq-r1引物对；引物clcn6-seq-f1的序列如seq id no.1所示；引物clcn6-seq-r1的序列如seq id no.2所示。
17、所述seq id no.1的引物序列为tcggcagtcctacctctagttc。
18、所述seq id no.2的引物序列为agactcagcagtgatgctatgc。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Clcn6基因敲入点突变小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的Clcn6基因点突变小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤一包括以下步骤：
3.根据权利要求1或2所述的Clcn6基因点突变小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤二包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的Clcn6基因点突变小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述PCR扩增采用Clcn6-seq-F1与Clcn6-seq-R1引物对；引物Clcn6-seq-F1的序列如SEQ IDNO.1所示；引物Clcn6-seq-R1的序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求3所述的Clcn6基因点突变小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述F1代小鼠基因组部分序列如图4所示。
6.一种Clcn6基因靶向载体，其特征在于，所述载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，sgRNA的作用位点的序列如SEQ ID NO:3所示。
7.一种如权利要求6所述的sgRNA在构建早发性
...【技术特征摘要】
1.一种clcn6基因敲入点突变小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的clcn6基因点突变小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤一包括以下步骤：
3.根据权利要求1或2所述的clcn6基因点突变小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤二包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的clcn6基因点突变小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述pcr扩增采用clcn6-seq-f1与clcn6-seq-r1引物对；引物clcn6-seq-f1的序列如s...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭镜，贺海兰，王晓乐，何芳，尹飞，林雪芹，羊蠡，熊娟，
申请(专利权)人：中南大学湘雅医院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。