【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水产动物病害学领域，具体涉及一种检测海水鱼类纤毛虫的特异性引物、试剂盒及其检测方法。
技术介绍
1、随着鱼类养殖业的快速发展，各种难以治愈的疾病已持续给病害的防治管理工作带来巨大的挑战，例如由盾纤类纤毛虫引起的疾病。盾纤类纤毛虫，广泛分布于自然水体和养殖水体中，是水体微食物环的重要组成部分，其中海洋尾丝虫uronema marinum，已经成为海水鱼类中最为常见和导致严重疾病的兼性寄生虫之一。尽管具有生态和经济的双重重要性，人们对这类纤毛虫的诊断仍然十分困难。
2、形态学方法是鉴定盾纤类纤毛虫的传统手段，然而在水产养殖业中，其应用受到了以下4个方面的限制：1)大部分盾纤类活体形态十分相似，对非分类学专家来说，银染后的形态仍然难于区别，难以区分海洋尾丝虫和其它非寄生盾纤类纤毛虫；2)孢子形态的盾纤类难于用光学显微镜来鉴定；3)用于形态学鉴定的银染技术非常复杂而且耗时；4)世界范围内，可为水产养殖业服务的原生生物分类学专家已十分稀少。因此，快速、简单和准确地鉴定盾纤类的新方法和试剂盒仍是人们的迫切需要。近年来，新兴的荧光原位杂交技术被认为是一种有效的检测技术，已在环境微生物检测中得到广泛运用。荧光原位杂交技术是根据已知生物不同分类级别上种群特异的dna序列，以利用荧光标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，与目标环境的生物基因组dna分子杂交，检测该特异生物种群的存在与丰度。然而，该技术在鱼类病害性纤毛虫的检测方面并没有得到充分应用。
技术实现思路
1、本专利技术的
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案为：
3、一种检测海洋尾丝虫的特异性引物，检测海洋尾丝虫的特异性引物序列为5'-tgccgattaaagatcaacatac-3'。
4、所述的特异性引物的应用，所述特异性引物作为探针在检测寄生于海水鱼类的海洋尾丝虫中的应用。
5、所述探针为在所述引物5'端标记花青类染料cy-3，即，探针um1280。
6、一种检测海水鱼类纤毛虫的试剂盒，试剂盒含所述特异性引物。
7、所述特异性引物序列5'端标记花青类染料cy-3，作为目标探针。
8、所述试剂盒包括含目标探针的甲酰胺杂交液、洗脱液和染色剂。
9、所述甲酰胺杂交液为甲酰胺(formamide)质量分数20％、探针um1280浓度30ng/μl、sds(sodium dodecyl sulfate)质量分数0.01％、nacl摩尔浓度0.9m、tris-hcl摩尔浓度20mm；
10、洗脱液为sds(sodium dodecyl sulfate)质量分数0.01％、nacl摩尔浓度0.9m、tris-hcl摩尔浓度20mm、edta摩尔浓度5mm；
11、染色剂为dapi溶液浓度1.5ng/ml。
12、一种所述试剂盒的应用，所述试剂盒在荧光原位杂交检测海水鱼类的海洋尾丝虫中的应用。
13、暗室中，将含目标探针的甲酰胺杂交液滴加到经固定液固定待测样品中于46℃下温育2小时，温育后在48℃经洗脱液水浴洗脱10分钟，洗脱后室温空干再与4',6-diamidino-2-phenylindole(dapi)溶液进行对比染色，染色后洗涤空干后于荧光显微镜下观测荧光强度。
14、所述通过荧光显微镜进行检测，发现橙红色荧光信号即表明待检测样品中含海洋尾丝虫
15、本专利技术所具有的优点：
16、本专利技术以大黄鱼、红鳍东方鲀、半滑舌鳎、大黄鱼和大菱鲆鱼类体内寄生的常见病害纤毛虫——海洋尾丝虫为测试对象，通过对其开发特异性核酸探针及试剂盒，并结合荧光原位杂交技术实现该类群的快速检测；检测方法具有操作简单，高特异性，灵敏和快速等特点。
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1.一种检测海洋尾丝虫的特异性引物，其特征在于：检测海洋尾丝虫的特异性引物序列为5'-TGCCGATTAAAGATCAACATAC-3'。
2.按权利要求1所述的特异性引物的应用，其特征在于：所述特异性引物作为探针在检测寄生于海水鱼类的海洋尾丝虫中的应用。
3.按权利要求2所述的特异性引物的应用，其特征在于：所述探针为在权利要求1所述引物5'端标记花青类染料Cy-3，即，探针Um1280。
4.一种检测海水鱼类纤毛虫的试剂盒，其特征在于：试剂盒含有权利要求1所述特异性引物。
5.按权利要求4所述检测海水鱼类纤毛虫的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物序列5'端标记花青类染料Cy-3，作为目标探针。
6.按权利要求4或3所述检测海水鱼类纤毛虫的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括含目标探针的甲酰胺杂交液、洗脱液和染色剂。
7.按权利要求6所述检测海水鱼类纤毛虫的试剂盒，其特征在于：
8.一种权利要求4所述试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂盒在荧光原位杂交检测海水鱼类的海洋尾丝虫中的应用。
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10.按权利要求9试剂盒的应用，其特征在于：所述通过荧光显微镜进行检测，发现橙红色荧光信号即表明待检测样品中含海洋尾丝虫。
...【技术特征摘要】
1.一种检测海洋尾丝虫的特异性引物，其特征在于：检测海洋尾丝虫的特异性引物序列为5'-tgccgattaaagatcaacatac-3'。
2.按权利要求1所述的特异性引物的应用，其特征在于：所述特异性引物作为探针在检测寄生于海水鱼类的海洋尾丝虫中的应用。
3.按权利要求2所述的特异性引物的应用，其特征在于：所述探针为在权利要求1所述引物5'端标记花青类染料cy-3，即，探针um1280。
4.一种检测海水鱼类纤毛虫的试剂盒，其特征在于：试剂盒含有权利要求1所述特异性引物。
5.按权利要求4所述检测海水鱼类纤毛虫的试剂盒，其特征在于：所述特异性引物序列5'端标记花青类染料cy-3，作为目标探针。
6.按权利要求4或3所述检测海水鱼类纤毛虫的试剂盒，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢尚微，陈万东，詹子锋，徐奎栋，
申请(专利权)人：南麂列岛国家海洋自然保护区管理局，
类型：发明
国别省市：
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