【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其是一种用于检测猪轮状病毒(porcinerotavirus，porv)的引物组合物、试剂盒及检测方法的。
技术介绍
1、猪轮状病毒，以下指代porv，porv是一种引起猪类腹泻的常见病原体，严重影响了畜牧业的经济效益。传统的porv检测方法包括电镜、病毒培养和免疫学检测，但这些方法存在耗时、复杂、昂贵和特异性不高等问题。因此，迫切需要一种新的、高效的porv检测方法。
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种引物组合物，包括特异性引物序列，能够选择性地扩增porv基因组的特定区域，这些技术，如聚合酶链反应(pcr)，能够快速且可靠地检测porv的存在。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术提供一种猪轮状病毒检测引物组合物，所述引物组合物包括检测引物和荧光探针；
4、检测引物组合为：
5、上游引物porv-f：agtgggtcggcaccagttc，其为seq id no.1序列；
6、下游引物porv-r：cctccaggatgcccatgttc，其为seq id no.2序列；
7、荧光探针porv-p：fam-gcgtagaactgtgacaacaacgctga-bhq1，其为seq id no.3序列，fam为荧光报告基因，bhq1为荧光淬灭基因。
8、本专利技术还提供一种猪轮状病毒检测试剂盒，包括上述引物组合物、酶系和扩增反应缓冲液
9、优选的，所述试剂盒中上游引物、下游引物的浓度均为0.1-1μm，荧光探针的浓度为0.1-1μm。
10、优选的，所述酶系为各种酶的混合物。
11、本专利技术还提供一种猪轮状病毒检测方法，利用上述检测试剂盒进行猪轮状病毒检测。
12、优选的，所述猪轮状病毒检测方法，包括以下步骤：
13、(1)反应体系配制：取出porv mix、酶系、阳性对照和阴性对照，置于室温下完全融解，充分颠倒混匀后短暂离心，配制成pcr反应液；其中，porv mix包括上下游引物、荧光探针、扩增反应缓冲液和过滤水，其中n为需要检测的样品数量。
14、(2)根据检测样品的数量向每个pcr反应管中加入15μl pcr反应液，然后取10μl的阴性对照、待检样品rna、阳性对照分别加入到不同的pcr反应管中，盖紧管盖，将pcr反应管瞬时离心；
15、(3)荧光pcr操作：将瞬时离心好的pcr管放入荧光pcr检测仪内，采用一步法使逆转录和扩增在同一管中进行。
16、(4)结果判定：通过荧光定量pcr仪自带软件读取相应的ct值，报告基团fam有扩增曲线出现的即是porv，若是无扩增曲线产生，则说明样品中不含porv，其中扩增曲线ct值小于35的判断为阳性，ct值大于35而小于40的判断为可疑，需重复实验，第二次ct值仍在这个范围的判断为阳性。
17、优选的，步骤(1)中porv mix和酶系以(14×n)μl+(1×n)μl＝(15×n)μl的比例计算所需配制反应数。
18、优选的，步骤(2)中反应程序设置为：第一阶段，50℃逆转录15min；第二阶段，95℃预变性2.5-3min；第三阶段，93-95℃变性10s，55-60℃延伸30s，共40-45个循环；荧光收集在第二阶段每次循环的55-60℃延伸时进行，选择fam荧光检测通道，收集fam荧光信号。
19、相较于现有技术，本专利技术的有益效果如下：
20、1、本专利技术提供了一种用于检测猪轮状病毒的探针引物组合物、试剂盒及其应用，本专利技术能够检测到1copies/μl的检出限，与现有技术相比，灵敏度有显著的提高；
21、2、本专利技术提供了一种用于检测猪轮状病毒的探针引物组合物、试剂盒及其检测方法，其设计的检测引物序列，仅与porv基因组中的特定区域高度匹配，确保了对porv的高度特异性检测，减少了误报的风险，使得结果更加可信；
22、3、本专利技术提供了一种用于检测猪轮状病毒的探针引物组合物、试剂盒及检测方法，具有卓越的灵敏度，能够检测到极低浓度的porv，这对于早期感染的检测至关重要，有助于及早采取控制措施，降低porv在猪群中的传播风险。
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1.一种猪轮状病毒检测引物组合物，其特征在于：所述引物组合物包括检测引物和荧光探针；
2.一种猪轮状病毒检测试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的引物组合物、酶系和扩增反应缓冲液。
3.如权利要求2所述的一种猪轮状病毒检测检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中上游引物、下游引物的浓度均为0.1-1μm，荧光探针的浓度为0.1-1μm。
4.如权利要求2所述的一种猪轮状病毒检测检测试剂盒，其特征在于：所述酶系为各种酶的混合物。
5.一种猪轮状病毒检测方法，其特征在于：利用权利要求2所述的检测试剂盒进行猪轮状病毒检测。
6.如权利要求5所述的一种猪轮状病毒检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的一种猪轮状病毒检测方法，其特征在于：步骤(1)中PoRV Mix和酶系以(14×n)μL+(1×n)μL＝(15×n)μL的比例计算所需配制反应数。
8.如权利要求6所述的一种猪轮状病毒检测方法，其特征在于：步骤(2)中反应程序设置为：第一阶段，50℃逆转录15min；第二阶段，95℃预变
...【技术特征摘要】
1.一种猪轮状病毒检测引物组合物，其特征在于：所述引物组合物包括检测引物和荧光探针；
2.一种猪轮状病毒检测试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的引物组合物、酶系和扩增反应缓冲液。
3.如权利要求2所述的一种猪轮状病毒检测检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中上游引物、下游引物的浓度均为0.1-1μm，荧光探针的浓度为0.1-1μm。
4.如权利要求2所述的一种猪轮状病毒检测检测试剂盒，其特征在于：所述酶系为各种酶的混合物。
5.一种猪轮状病毒检测方法，其特征在于：利用权利要求2所述的检测试剂盒进行猪轮状病毒检测。
6.如权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨振坦，张荣才，钱红运，曾繁煌，
申请(专利权)人：福建农业职业技术学院，
类型：发明
国别省市：
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