【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其涉及一种促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法。
技术介绍
1、将人工合成dna组装成较大的dna片段甚至是全基因组后，需要用这些合成的序列替换掉原有的野生型序列，并保持原有细胞的存活。对于拥有小型基因组的病毒如poliovirus，合成的基因组cdna可通过rna聚合酶转录成病毒rna，然后就可以体外在细胞提取液中进行翻译和复制，组装成一个有功能的病毒颗粒。对于基因组较大的原核生物和真核生物，基因组替换的过程要困难许多。对于在酵母中组装完成的基因组(mycoplasmagenitalium、mycoplasmamycoides和jcvi-syn3.0最小基因组)，可以通过原生质体融合来实现酵母和其他生物间基因组的快速转移。而对于酵母自身基因组的合成，则采用了基于同源重组的逐步替换的方法。对于酵母以外的生物，直接依赖于自身的同源重组系统并不能够满足快速进行基因组替换的需求。
2、c.reinhardtii叶绿体基因组最显著的特征为含有自身含量～20％的重复dna序列，大多数基因间区域由多种类型的短散布重复序列(short dispersed repeats(sdrs))组成，通过比对c.reinhardtii叶绿体基因组与其他叶绿体基因组的序列相似性及dna重复性，发现尽管一些sdrs可能来自于其他基因组片段，但大部分的sdrs并非来自现存的编码序列。在包括陆生植物和绿藻在内的绿色植物中，已测序的叶绿体基因组中只有小球藻具有大量的sdrs，但令人惊讶的是，小球藻和c.reinhar
3、因此，现有技术仍有待于改进和发展。
技术实现思路
1、鉴于上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，通过利用talens(transcription activator-likeeffectornucleases，转录激活因子样效应子核酸酶)技术转化莱茵衣藻叶绿体基因组，旨在解决如何有效快速地实现将新合成莱茵衣藻叶绿体基因组替换野生型莱茵衣藻叶绿体基因组的问题。
2、具体地，本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术提供了一种促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，包括：
4、步骤s1、选取莱茵衣藻叶绿体基因组中短散布重复序列sdrs作为talens靶序列，设计talens识别位点；
5、步骤s2、设计识别所述talens识别位点的核酸酶蛋白质序列，合成得到编码所述核酸酶的核苷酸序列；
6、步骤s3、构建talens表达模块载体；
7、步骤s4、合成组装新合成莱茵衣藻基因组，所述新合成莱茵衣藻基因组包括不含所述talens识别位点的莱茵衣藻叶绿体基因组、所述talens表达模块、抗性筛选标记和pcr水印标签；
8、步骤s5、将所述新合成莱茵衣藻叶绿体基因组转入大肠杆菌中扩繁质粒，将所述质粒转化进入野生型莱茵衣藻叶绿体中；
9、步骤s6、筛选、功能验证转化的莱茵衣藻细胞，实现新合成莱茵衣藻叶绿体基因组对野生型莱茵衣藻叶绿体的替换和同质化。
10、可选地，所述步骤s1中，所述talens靶序列长度为49-51bp；
11、可选地，所述步骤s1中，所述talens靶序列为seq id no.1和/或seq id no.2所示的核苷酸序列。
12、可选地，所述步骤s1中，所述talens识别位点包括talens左臂识别位点和talens右臂识别位点，所述talens左臂识别位点或所述talens右臂识别位点的序列长度为16-17bp，所述talens左臂位点和所述talens右臂识别位点之间的间隔序列长度为14bp。
13、可选地，当所述talens靶序列为seq id no.1所示的核苷酸序列时，所诉talens左臂识别位点为2-18位核苷酸，记为1l；所述talens右臂识别位点为33-49位核苷酸，记为1r；
14、当所述talens靶序列为seq id no.2所示的核苷酸序列时，所述talens左臂识别位点为4-20位核苷酸，记为2l；所述talens右臂识别位点为35-50位核苷酸，记为2r。
15、可选地，所述步骤s2中，所述核酸酶包括识别所述talens识别位点的tal效应蛋白和fok i限制性核酸內切酶；
16、其中，识别1l的所述核酸酶为由seq id no.7所示核苷酸序列编码的蛋白质talen-1l，所述talen-1l包括tal效应蛋白tal-1l和fok i限制性核酸內切酶；
17、识别1r的所述核酸酶由seq id no.8所示核苷酸序列编码的蛋白质talen-1r，所述talen-1r包括tal效应蛋白tal-1r和fok i限制性核酸內切酶；
18、识别2l的所述核酸酶为由seq id no.9所示核苷酸序列编码的蛋白质talen-2l，所述talen-2l包括tal效应蛋白tal-2l和fok i限制性核酸內切酶；
19、识别2r的所述核酸酶由seq id no.10所示核苷酸序列编码的蛋白质talen-2r，所述talen-2r包括tal效应蛋白tal-2r和fok i限制性核酸內切酶。
20、可选地，所述步骤s3中,，所述talens表达模块包括启动子atpa、所述seq id no.7核苷酸序列的orf、连接片段iee、所述seq id no.8核苷酸序列的orf和rbcl3’终止子；
21、或者，所述talens表达模块载体包括启动子atpa、所述seq id no.9核苷酸序列的orf、连接片段iee、所述seq id no.10核苷酸序列的orf和rbcl3’终止子。
22、可选地，所述步骤s4中，所述新合成莱茵衣藻叶绿体基因组全长为194,336bp。
23、可选地，所述步骤s4中，所述抗性筛选标记包括aada、aphviii和cat。
24、本专利技术具有以下有益效果：
25、本专利技术提供了一种促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，该技术方法基于短散布重复序列sdrs在莱茵衣藻叶绿体基因组分布均匀的特点，通过设计合成不含talen识别位点且包含talens表达模块的新合成莱茵衣藻叶绿体基因组，质粒转化入莱茵衣藻叶绿体后，新合成基因组免于被talens切割，而被talens切割成片段的野生型基因组被降解，实现了在转化的莱茵衣藻叶绿体中新合成基因组将野生型基因组序列替换并同质化的目的，本专利技术所提供的促进本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，步骤S1中，所述TALENs靶序列长度为49-51bp。
3.根据权利要求2所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，所述TALENs靶序列为SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，步骤S1中，所述TALENs识别位点包括TALENs左臂识别位点和TALENs右臂识别位点，所述TALENs左臂识别位点或所述TALENs右臂识别位点的序列长度为16-17bp，所述TALENs左臂位点和所述TALENs右臂识别位点之间的间隔序列长度为14bp。
5.根据权利要求1～4任一所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，当所述TALENs靶序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列时，所述TALENs左臂识别位点为2-18位核
6.根据权利要求1或5所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，步骤S2中，所述核酸酶包括识别所述TALENs识别位点的TAL效应蛋白和Fok I限制性核酸內切酶；
7.根据权利要求1或6所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述TALENs表达模块包括启动子atpA、所述SEQ ID NO.7核苷酸序列的ORF、连接片段IEE、所述SEQ ID NO.8核苷酸序列的ORF和rbcL3’终止子；
8.根据权利要求1所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述新合成莱茵衣藻叶绿体基因组全长为194,336bp。
9.根据权利要求1所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，所述步骤S4中，所述抗性筛选标记包括aadA、aphVIII和cat。
...【技术特征摘要】
1.一种促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，步骤s1中，所述talens靶序列长度为49-51bp。
3.根据权利要求2所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，所述talens靶序列为seq id no.1和/或seq id no.2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，步骤s1中，所述talens识别位点包括talens左臂识别位点和talens右臂识别位点，所述talens左臂识别位点或所述talens右臂识别位点的序列长度为16-17bp，所述talens左臂位点和所述talens右臂识别位点之间的间隔序列长度为14bp。
5.根据权利要求1～4任一所述的促进衣藻叶绿体基因组高效替换与同质化的技术方法，其特征在于，当所述talens靶序列为seq id no.1所示的核苷酸序列时...
【专利技术属性】
技术研发人员：张桂英，胡章立，郭春立，贾彬，李欣怡，江亚男，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：
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