【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种假马齿苋p450酶基因bmcyp068及在制备23-oh-dammarenediol ii和25-oh-dammarenediol ii中的应用。
技术介绍
1、假马齿苋bacopa monnieri(l.)wettst.是玄参科(scrophulariaceae)假马齿苋属bacopa aubl.植物，主要分布在热带和亚热带地区，多见于水边、湿地及沙滩等地方，在我国主要分布在台湾、福建、广东、云南等省份。假马齿苋是印度传统阿育吠陀医学的一种备受推崇的草本植物，被公认为补脑的高价值药用植物，能够改善记忆和智力。全球不同的研究小组探索假马齿苋用于治疗痴呆症、健忘症、记忆功能障碍、帕金森病、阿尔茨海默病、癫痫发作和精神分裂症。除神经保护外，假马齿苋还具有镇静、抗菌、抗炎、抗惊厥、抗衰老、支气管血管扩张、抗癌、抗抑郁药、抗呕吐和抗溃疡活性。据报道，假马齿苋这些潜在的药理活性与其次生代谢物达玛烷型三萜皂苷密切相关。
2、假马齿苋中的三萜类皂苷含量丰富种类繁多，按其结构可以分为达玛烷型、葫芦烷型、羽扇豆醇型、乌苏烷型等。其中，达玛烷型三萜皂苷是最常见的一类成分，这些化合物与植物的潜在药理作用息息相关。该类化合物多以糖苷形式存在，其母核结构主要以酸枣仁皂苷元和伪酸枣仁皂苷元为主，这些化合物的区别在于连接的糖基种类和方式多种多样。
3、假马齿苋中的三萜皂苷含量低，结构复杂，从植物材料中提取需要大量的原材料。然而，目前假马齿苋现存资源多为野生状态，数量稀少且分布零散，而且分离的成本高，化学
4、酸枣仁皂苷元和伪酸枣仁皂苷元作为假马齿苋三萜皂苷的关键中间体，鉴定其生物合成的酶成为重中之重。但迄今为止，负责假马齿苋中酸枣仁皂苷元和伪酸枣仁皂苷元生成的相关酶功能尚未得到验证，影响了假马齿苋中达玛烷型三萜皂苷生物合成工作的推进。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种假马齿苋p450酶基因bmcyp068，可作为假马齿苋三萜皂苷的生物合成中形成23-oh-dammarenediol ii和25-oh-dammarenediol ii调控基因以及应用于制备23-oh-dammarenediol ii和25-oh-dammarenediol ii。
2、为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
3、本专利技术第一方面提供一种假马齿苋p450酶基因bmcyp068，假马齿苋p450酶基因bmcyp068核苷酸序列如seq id no.1所示，序列全长1554bp。
4、本专利技术第二方面提供上述假马齿苋p450酶基因bmcyp068编码蛋白，该编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示，编码了518个氨基酸残基。
5、本专利技术第三方面提供含有上述假马齿苋p450酶基因bmcyp068的重组质粒。
6、进一步，优选的是，将假马齿苋p450酶基因bmcyp068与y33载体同源重组，获得y33-bmcyp068重组质粒。
7、本专利技术第四方面提供一种转基因工程菌，含有上述重组质粒，或，所述基因工程菌的基因组中整合有外源的上述假马齿苋p450酶基因bmcyp068。
8、进一步，优选的是，所述转基因工程菌为酿酒酵母dammarenediol i i底盘细胞。
9、本专利技术第五方面提供上述假马齿苋p450酶基因bmcyp068编码得到的假马齿苋p450酶bmcyp068。
10、本专利技术第六方面提供上述假马齿苋p450酶基因bmcyp068在制备23-oh-dammarenediol ii和25-oh-dammarenediol ii中的应用。
11、进一步，优选的是，以底盘细胞产生的dammarenediol ii为底物，在由所述的假马齿苋p450酶基因bmcyp068编码得到的假马齿苋p450酶bmcyp068的催化下经过侧链23位或25位羟基化生成23-oh-dammarenediol ii和25-oh-dammarenediol ii。
12、本专利技术通过重组质粒，在酿酒酵母底盘细胞中表达后获得目标蛋白，经进一步对底物dammarenediol ii进行催化，直接生成23-oh-dammarenediol ii和25-oh-dammarenediol ii。
13、本专利技术所述的假马齿苋p450酶基因bmcyp068，是从假马齿苋的植株中，通过转录组测序及生物信息学技术，经大量实验后筛选后得以鉴定出来的；经过密码子优化，通过人工合成的方法获得。所述的假马齿苋p450酶基因bmcyp068的扩增引物如下所示：
14、5'f：atggcagttaaattgagcagc；(seq id no.3)
15、3'r：ttacaatttgtgcaaaaccatagaagc。(seq id no.4)
16、此外，与载体y33进行同源重组时，bmcyp068基因则需要使用用带同源壁的引物进行扩增及回收，带同源壁的引物如下：
17、上游同源臂引物：5'f：cagtcgacctcgaatctaga atggcagttaaattgagcagc；(seq idno.5)。
18、下游同源臂引物：3'r：
19、ctaattacatgatgcggcccttacaatttgtgcaaaaccatagaagc(seq id no.6)。
20、从假马齿苋中分离并鉴定的p450酶基因bmcyp068，可作为假马齿苋的分子辅助育种的重要标记基因，同时也可作为酵母底盘细胞构建中生产23-oh-dammarenediol ii和25-oh-dammarenediol ii及假马齿苋皂苷的重要候选基因。
21、本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：
22、本专利技术提供p450酶基因bmcyp068可作为23-oh-dammarenediol ii和25-oh-dammarenediol ii的生物合成调控基因，并应用于制备
23、23-oh-dammarenediol ii和25-oh-dammarenediol ii。
24、(1)随着生物信息学技术的飞速发展，极大地推进了三萜类化合物生物合成路径关键酶基因的挖掘，本专利技术中23-oh-dammarenediol ii和25-oh-dammarenediol ii的生物合成调控基因即p450酶基因bmcyp068，是在假马齿苋中首次鉴定并成功验本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种假马齿苋P450酶基因BmCYP068，其特征在于，假马齿苋P450酶基因BmCYP068核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的假马齿苋P450酶基因BmCYP068编码蛋白，其特征在于，该编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.含有权利要求1所述的假马齿苋P450酶基因BmCYP068的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的含有假马齿苋P450酶基因BmCYP068的重组质粒，其特征在于，将假马齿苋P450酶基因BmCYP068与Y33载体同源重组，获Y33-BmCYP068重组质粒。
5.一种转基因工程菌，含有权利要求3所述的重组质粒，或，所述基因工程菌的基因组中整合有外源的权利要求1所述的假马齿苋P450酶基因BmCYP068。
6.根据权利要求5所述的转基因工程菌，其特征在于，所述转基因工程菌为Dammarenediol II酿酒酵母底盘细胞。
7.权利要求1所述的假马齿苋P450酶基因BmCYP068编码得到的假马齿苋P450酶BmCYP068。
...【技术特征摘要】
1.一种假马齿苋p450酶基因bmcyp068，其特征在于，假马齿苋p450酶基因bmcyp068核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.权利要求1所述的假马齿苋p450酶基因bmcyp068编码蛋白，其特征在于，该编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
3.含有权利要求1所述的假马齿苋p450酶基因bmcyp068的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的含有假马齿苋p450酶基因bmcyp068的重组质粒，其特征在于，将假马齿苋p450酶基因bmcyp068与y33载体同源重组，获y33-bmcyp068重组质粒。
5.一种转基因工程菌，含有权利要求3所述的重组质粒，或，所述基因工程菌的基因组中整合有外源的权利要求1所述的假马齿苋p450酶基因bmcyp068。
6.根据权利要求5所述的转基因工程菌，其特征在于，所述转基因工程菌为...
【专利技术属性】
技术研发人员：张广辉，张双艳，刘祥宇，杨生超，赵艳，和四梅，郝冰，卢迎春，向贵生，冯垒，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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