【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物快速检测，具体涉及基于rpa-crispr-cas12a的常见致病菌快速检测试剂盒及检测方法，特别是在金黄色葡萄球菌、海洋创伤弧菌、沙门氏菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等常见致病菌中的检测应用。
技术介绍
1、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)是一种常见的致病菌，能引起多种感染，如皮肤软组织感染、呼吸道感染、血流感染等。此外，金黄色葡萄球菌还是一种多重耐药菌，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus)菌株已经引起了越来越多的关注。创伤弧菌(vibrio vulnificus)是一种能够引起剧烈胃肠炎和伤口感染的革兰氏阴性菌。创伤弧菌感染通常是通过生食或未煮熟的海产品(尤其是贝类和虾类)引起的，创伤弧菌感染的严重程度因感染途径、剂量和宿主免疫状况而异，轻者可能只有腹泻、呕吐和腹痛等症状，而重者则可能引起败血症、坏死性筋膜炎等严重感染，甚至危及生命。沙门氏菌(salmonella)是一类常见的细菌，可引起沙门氏菌感染，通常通过食物和水源传播，也可以通过接触受感染的动物或其粪便传播。沙门氏菌感染症状通常包括腹泻、发热、恶心、呕吐和腹痛等，病情轻重不一，严重感染可能导致死亡。
2、近年来，由于耐药菌株的出现，致病菌感染呈现上升的趋势。致病菌的检测不及时会导致患者滥用抗生素，进而导致一些细菌形成抗药性。同时，感染症状和体征不明显也容易错过最佳治疗时期。因此，通过检测致病菌，可以明确疾病的病原体和抗生素敏感性，
3、crispr-cas技术是近年来发展迅猛的基因编辑技术，成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，crispr)及其相关蛋白(crispr-associated proteins,cas)构成crispr-cas系统。crispr-cas系统原本是存在于原核生物体内的一种适应性免疫机制。目前，经过一系列的改造，crispr-cas技术已在基因组编辑、基因表达调控、基因治疗、病原体检测、靶基因高通量筛选、表观遗传修饰等多个生命科学的研究领域被广泛应用。除了作为基因编辑工具，ⅱ类cas蛋白如cas12a蛋白具有的“非特异性单链dna切割”特性，已被开发成识别不同类型靶标的核酸检测方法，在快速检测领域具有重大潜力。
4、重组酶聚合酶扩增(rpa)是一种新型的恒温核酸扩增技术，广泛用于病原菌核酸分子诊断。rpa用三种核心酶替代了聚合酶链式反应(pcr)所需的热循环，不同于许多其他等温技术，rpa省去了升高或精确控温阶段，其最显著的优势就是可在25～42℃的恒温下实现特定核酸序列的扩增，可以在10～40min内完成数十亿的dna拷贝。rpa属于等温扩增技术，对仪器设备要求低，仅需要恒温水浴锅即可完成反应，无需精密仪器，具有反应迅速、灵敏度高、特异性强、低温运行、适用性广、试剂形态灵活和检测形式多样等优势，可成为传统pcr方法的替代品。
5、2015年，研究发现了crispr相关蛋白内切酶cas12a，与常用的cas9蛋白一样，是rna引导的特异性dna核酸内切酶，但与cas9相比，cas12a又有自身特点，比如仅需要crrna即可引导特异性切割双链dna，并产生粘性末端等。cas12a一旦识别并切割由crrna序列指定的靶标dna，它就转入了一种酶促“激活”状态，这时它能将任意非靶标的单链dna切成碎片，这种作用称之为旁路切割活性。2018年，研究者基于rna引导和dna靶向的核酸内切酶cas12a的旁路切割效应结合dna等温扩增，建立了基于crispr的核酸检测方法detectr；首先通过rpa的方法大量扩增得到包含靶序列的片段，然后将扩增产物加入cas12a检测体系中，一旦cas12a和grna复合体识别切割靶序列之后，可以触发对于非特异性单链的切割活性，检测体系中的单链报告分子被切割，发出荧光，从而确认靶序列的存在，可用于dna病毒和snp的检测。该检测方法不需要昂贵的试剂和特殊仪器，成本低，操作简便，检测灵敏度高，可以达到单分子检测水平，特异性强，检测靶序列dna非常方便。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供基于rpa-crispr-cas12a的常见致病菌快速检测试剂盒及检测方法。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术提供一种常见致病菌快速检测组合物，所述组合物为crrna与cas12a结合形成的功能性组合物，所述crrna的核苷酸序列如seq id no:1～4所示。
4、本专利技术还提供如上所述的组合物在检测常见致病菌中的应用，常见致病菌为金黄色葡萄球菌、海洋创伤弧菌、沙门氏菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
5、本专利技术还提供如上所述的组合物在制备常见致病菌检测产品中的应用。
6、本专利技术提供基于rpa-crispr-cas12a的常见致病菌快速检测体系，包括如上所述的组合物、用于扩增常见致病菌特异性序列的rpa引物对和探针。
7、进一步的，用于扩增常见致病菌特异性序列的rpa引物对的上游引物核苷酸序列如seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11所示；下游引物核苷酸序列如seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12所示。
8、进一步的，所述探针为荧光基团和淬灭基团双标记的单链dna探针，探针的5’端标记荧光基团六氯-6-甲基荧光素(hex)，3’端标记淬灭基团(bhq1)；所述探针的核苷酸序列如seq id no:13所示。
9、本专利技术提供基于rpa-crispr-cas12a的常见致病菌快速检测试剂盒，包括如上所述的基于rpa-crispr-cas12a的常见致病菌快速检测体系。
10、本专利技术还提供基于rpa-crispr-cas12a的常见致病菌快速检测方法，包括以下步骤：
11、s1、提取待测样品核酸；
12、s2、以样品dna为模板，利用rpa引物对进行等温扩增反应，得到rpa扩增产物；
13、s3、利用上述crrna与cas12a结合的组合物，再加入探针及步本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.常见致病菌快速检测组合物，其特征在于，所述组合物为crRNA与Cas12a结合形成的功能性组合物，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～4所示。
2.如权利要求1所述的组合物在检测常见致病菌中的应用，其特征在于，所述常见致病菌为金黄色葡萄球菌、海洋创伤弧菌、沙门氏菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
3.如权利要求1所述的组合物在制备常见致病菌检测产品中的应用，其特征在于，所述常见致病菌为金黄色葡萄球菌、海洋创伤弧菌、沙门氏菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
4.基于RPA-CRISPR-Cas12a的常见致病菌快速检测体系，其特征在于，包括如权利要求1所述的组合物、用于扩增常见致病菌特异性序列的RPA引物对和探针。
5.如权利要求4所述的基于RPA-CRISPR-Cas12a的常见致病菌快速检测体系，其特征在于，用于扩增常见致病菌特异性序列的RPA引物对的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11所示；下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO:6、SE
6.如权利要求4所述的基于RPA-CRISPR-Cas12a的常见致病菌快速检测体系，其特征在于，所述探针为荧光基团和淬灭基团双标记的单链DNA探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
7.基于RPA-CRISPR-Cas12a的常见致病菌快速检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求4至6任一所述的基于RPA-CRISPR-Cas12a的常见致病菌快速检测体系。
8.基于RPA-CRISPR-Cas12a的常见致病菌快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.常见致病菌快速检测组合物，其特征在于，所述组合物为crrna与cas12a结合形成的功能性组合物，所述crrna的核苷酸序列如seq id no:1～4所示。
2.如权利要求1所述的组合物在检测常见致病菌中的应用，其特征在于，所述常见致病菌为金黄色葡萄球菌、海洋创伤弧菌、沙门氏菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
3.如权利要求1所述的组合物在制备常见致病菌检测产品中的应用，其特征在于，所述常见致病菌为金黄色葡萄球菌、海洋创伤弧菌、沙门氏菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
4.基于rpa-crispr-cas12a的常见致病菌快速检测体系，其特征在于，包括如权利要求1所述的组合物、用于扩增常见致病菌特异性序列的rpa引物对和探针。
5.如权利要求4所述的基于rpa-crispr-cas12a的常见致病菌快速检测体系，其特征在于，用于扩增...
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