一种春兰杂交和种子无菌播种育苗方法技术

本发明专利技术提供一种春兰杂交和种子无菌播种育苗方法，通过人工授粉后获得杂交种子，待朔果未完全成熟时采下、经表面消毒后进行无菌播种，在黑暗中培养、萌发后获得根状茎、接入诱导芽培养基，根状茎诱导芽、生根壮苗培养及试管苗移栽等步骤。本发明专利技术采用三种经筛选优化的培养基，使春兰杂交种子萌发率高，育苗周期缩短，种苗品质好。本发明专利技术的整套方法，可操作性强，较好的解决了春兰杂交种子由于胚发育不完全，自然条件下极难萌发的困难，具有较高的应用和推广价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物生物
，具体为春兰的杂交育种和种子繁殖方法。
技术介绍
兰花是我国的传统特色花卉，中国兰通常是指兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidum)植物中一部分地生种，如春兰(C. goeringii)、蕙兰(C. faberi)、建兰 (C. ensifolium)、墨兰(C. sinense)和寒兰(C. kanran)等。兰花淡雅幽香，倍受诗画赞美， 被誉为“花中君子”，儒家文化崇尚“君子比德”，常以花喻人，使得兰花在东南亚国家也十分 流行。兰花优良品种量少价高，主要靠引种驯化获得新品种，自20世纪80年代以来，各地 利用当地的资源优势，进行了大规模的引种选育工作，即为野外大量挖掘后栽培筛选，虽然 培育出了一批新品种，但对野生资源的破坏也是有目共睹的。近十几年来，国内开展了针对 当地国兰资源特色的杂交育种科研，如广东的墨兰，福建的建兰和寒兰，四川的春剑和云南 的莲瓣兰等，由于兰花种子极为细小，一粒朔果中有成千上万的种子，但种子没有胚乳和子 叶，透明种皮内只有一发育不完全的蝌蚪形胚，常规播种很难萌发，因此必须通过组培无菌 播种的方法进行萌发。各地国兰的杂交研究有这明显的地域性，有的主要以科研为主，选择 的亲本多为性状一般的草兰、草兰的自然杂交或自交，这对优秀后代的获得不利。江浙是 春兰和蕙兰的主产区，沿海经济发达，爱兰人士众多，兰花新品种价格奇高，使得野外挖掘 量大，交易频繁，资源破坏严重，因此，发挥江浙当地的春兰资源优势，有目的地选择性状优 良的亲本，开展春兰品种间以及和兰属内的其它种进行种间杂交，成功研发出春兰杂交种 子无菌播种，提高萌发率，根状茎诱导芽，生根壮苗培养和试管苗移栽等无菌播种成苗的关 键技术，从而选育幽香、花型、花色、彩斑、株型、抗病或生长快速等特性的兰花新品种，其科 研、环保和生产意义非常重大，是对国兰早日产业化和可持续发展的有力保证。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对春兰杂交育种和种子无菌播种中，如何提高优良品种授粉结 实率、种子萌发率、诱芽成苗率和试管苗移栽成活率等，提出一种使杂交成苗快、品质好，高 效、简便、推广性强的春兰杂交和种子无菌播种育苗方法，是通过解决亲本选择、授粉培育、 果实消毒、前期暗培养、播种成苗过程的三种培养基筛选、移栽介质筛选等关键技术，来实 现专利技术的目的。本专利技术，具体通过以下步骤实现(1)获得人工授粉的杂交种子以具有性状优势互补的春兰名品为亲本(母本)， 开花2 20天内进行人工授粉，为防昆虫，授粉前亲本的唇瓣要去掉，授粉前后要用透气白 色无纺布包盖蕊柱或整朵花套授粉袋，若花期不遇，花粉块可在3 5°C低温、干燥(硅胶) 条件下冷藏备用。所述春兰名品是在瓣型、花色、花大或彩叶上有优势的品种。所述人工授粉的操作为兰花授粉的常规方法，是用尖头的钟表镊子将亲本的花药 帽去掉，将两个大花粉块取下，分别放在干净的白纸上，两个大花粉块可以自然分成4小块，将父本花粉块用镊子捡取小心地放在母本的蕊柱凹槽处，注意手势轻巧，防止镊子尖头碰伤蕊柱凹槽壁，4个花粉块可以授4朵花，以作后备选择，从而保证授粉的成功率，父母本 也可以互为进行正反交，所述人工授粉的操作为兰花授粉的常规方法，开花授粉的时间段 为春兰上试验结果。为防昆虫，授粉前亲本的唇瓣可去掉，防止昆虫停留，授粉前与授粉后要用小块的 透气白色无纺布包盖蕊柱，或是用透气的半透明纸做的授粉袋套住整朵花，待授粉成功后 再去掉。若亲本花期不遇，可将父本的花粉块取下放于小的自封口塑料袋、小注射药瓶或 塑料指形管中盖好，再放到有干燥剂硅胶铺垫的塑料饭盒中，在干燥低温(3 5°C)的冰箱 中冷藏备用，当母本开花时，将保存的父本花粉块取出，放在白纸上，在温度(20 25°C左 右)和湿度(70 80%)适宜的自然环境下放置30 40分钟，再进行授粉。用氯化三苯四氮唑(TTC)染色法可以测定花粉块生活力，配制0. 5%的四氮唑溶 液，每月对花粉块取样，将花粉块放在载玻片上，加一滴四氮唑溶液，在适宜的温湿度环境 下放置20 30分钟后观察着色情况，呈红色为正常花粉，结果表明花粉块可保存8 10 月。人工授粉后，结实期长达5 7个月，必须要加强肥水管理，可以施用爱贝施 (APEX) 2号或好康多1号长效缓释颗粒肥，每盆5 10克左右，以促进结实，并获得量多的 种子，如果因管理不当或亲缘关系较远，后期出现败育，果柄脱落，可尝试提前进行胚抢救 处理，但由于种子发育还不够成熟，呈浆状或种子量少，萌发就极为困难。(2)无菌播种待朔果未完全成熟时采下，清洗果实表面，用10%的次氯酸钠 (NaClO)浸泡10 20分钟进行表面消毒，无菌水冲洗，用滴管吸取悬浮于无菌水中的种子， 均勻滴播于播种培养基上。播种培养基1/2MS+NAA4 5mg/l+活性炭2g/l+蔗糖20g/l+ 琼脂8 10g/l，pH5.4。所述的朔果未完全成熟时，是指朔果膨大、表面呈黄绿色、达到八 成熟未开裂时。成熟开裂的果实对消毒和萌发都不利。无菌播种方法是切除多余果柄，清洗果实 表面，将果实放入烧杯，经自来水冲洗30分钟后，放在超净工作台上，用70 75%酒精浸 泡30秒钟，无菌水冲洗3次，再经10%次氯酸钠溶液浸泡10 20分钟进行表面消毒，无 菌水冲洗5次，将消毒好的果实放在无菌滤纸上纵切，可以看到大量细如白絮的种子，将种 子刮入装有无菌水的烧杯中，使种子呈悬浮状态，用无菌滴管吸入，均勻滴播于播种培养基 上，轻摇三角瓶，使种子均勻分布在培养基表面，三角瓶放在20 25°C的黑暗条件下培养 2 3个月，促进种子后熟，以后再放到散射光下培养，光照强度800 lOOOlux，每天光照 12小时，播种3个月左右，种子内的胚发育突破种皮，形成原球茎(protocorm)，原球茎继续 生长，伸长，形成根状茎(rhizome)。根状茎可以直接诱导芽，也可以保持在继代增殖状态。播种培养基中1/2MS是指MS(MuraShige-Sk00g 1962)基本培养基的母液1、母液 2和母液3等大量元素母液的用量减半，其它铁盐、微量元素和维生素母液用量保持不变。 培养基略偏酸性或琼脂量减少些，使凝固度低，培养基偏软些，对种子萌发更有利。种子发育镜检可以用来判断种子发育的完好程度，对萌发率有影响，方法是将消 毒后没播完的种子用滴管吸入，滴于载玻片上，根据种子数决定滴几滴，一般是1 2滴，盖 上盖玻片时防止气泡产生，在OLMPUS万能生物显微镜下进行观察，在2. 5X目镜和4X物镜下选取10个镜面，统计好胚、弱胚、无胚的个数，计算出好胚率。一般种子大致可以分成 三类饱满、发育正常的种子(好胚)；发育不良、胚乳较小的种子(弱胚)；没有胚、空壳的 败育种子(无胚)。只有发育正常的种子，才能在适宜的培养基和环境下萌发。(3)根状茎诱导芽播种后在黑暗中培养，使种子在模拟自然生态条件的环境以 及富有营养的培养基中后熟生长，萌发后获得根状茎，待根状茎长至1. 5 2cm长时，接入 诱导芽培养基，放在温度20 25°C，在双支日光灯光照强度25001uX左右，光照12小时/ 天的条件下培养2 3个月，在根状茎的顶端和侧面有芽点抽出，伸长，当芽高4-5cm时可 转至生根壮苗培养。为了本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种春兰杂交和种子无菌播种育苗方法，通过以下步骤实现：（１）获得人工授粉的杂交种子：以具有性状优势互补的春兰名品为亲本，开花２～２０天内进行人工授粉，为防昆虫，授粉前亲本的唇瓣要去掉，授粉前后要用透气白色无纺布包盖蕊柱或整朵花套授粉袋，若花期不遇，花粉块可在３～５℃低温、干燥条件下冷藏备用；（２）无菌播种：待朔果未完全成熟时采下，清洗果实表面，用１０％的次氯酸钠浸泡１０～２０分钟进行表面消毒，无菌水冲洗，用滴管吸取悬浮于无菌水中的种子，均匀滴播于播种培养基上，播种培养基为：１／２ＭＳ＋ＮＡＡ４～５ｍｇ／ｌ＋活性炭２ｇ／ｌ＋蔗糖２０ｇ／ｌ＋琼脂８～１０ｇ／ｌ，ｐＨ５．４；（３）根状茎诱导芽：播种后在黑暗中培养，萌发后待根状茎长至１．５～２ｃｍ长时，接入诱导芽培养基，放在温度２０～２５℃，在光照强度２５００ｌｕｘ左右，光照１２小时／天的条件下培养２～３个月，在根状茎的顶端和侧面有芽点抽出，伸长，当芽高４－５ｃｍ时可转至生根壮苗培养，根状茎诱导芽培养基为：１／２ＭＳ＋ＮＡＡ０．２～０．５ｍｇ／ｌ＋ＢＡ１～２ｍｇ／ｌ＋蔗糖２０ｇ／ｌ＋琼脂８～１０ｇ／ｌ，ｐＨ５．４；（４）生根壮苗培养：待芽高４－５ｃｍ时转至生根壮苗培养，放在温度２０～２５℃，光照强度２５００ｌｕｘ左右，光照１２小时／天的条件下培养２～３个月，在培养后期的１～２个月，放在温室内，靠自然光照培养，生根壮苗培养基：１／２ＭＳ＋ＮＡＡ１～２ｍｇ／ｌ＋ＩＢＡ０．２～０．５ｍｇ／ｌ＋ＢＡ０．５ｍｇ／ｌ＋活性炭２ｇ／ｌ＋蔗糖２０ｇ／ｌ＋琼脂８～１０ｇ／ｌ，ｐＨ５．４；（５）试管苗移栽：当小苗长至高６－７ｃｍ，根数２～３条，叶片３～４片时，即移栽，移栽介质为珍珠岩∶蛭石∶泥炭＝２∶１∶１。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李方，黄焱，柴明良，夏宜平，陈昆松，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]