一种海伦兜兰原球茎的低温保存培养基及低温保存繁殖方法技术

本发明专利技术公开了一种海伦兜兰原球茎的低温保存培养基及低温保存繁殖方法。它是将无菌播种获得的原球茎转移至低温保存培养基中，在合适的条件下培养，然后将低温保存的原球茎转移至恢复生长培养基中，在合适的条件下，恢复生长分化出小苗，经生根壮苗培养获得完整植株。本发明专利技术的方法具有保存成本低、操作简单、植物材料复苏快、生活力高等优点，在需要进行种苗的大规模生产时，能在短期内获得大量的试管苗，对于解决快繁生产急用及种质资源的保存也均具有极其重要的价值。

Low temperature preservation medium for Helen protocorm and low temperature preserving propagation method

The invention discloses a low temperature preservation medium for Helen protocorm and a low temperature preservation propagation method. It is the aseptic seeding of protocorm transferred to the cryopreservation medium, cultured in suitable conditions, and then cryopreserved protocorms to restore growth medium, under suitable conditions, the recovery of growth differentiation seedlings, the rooting plantlets were acquired. The method of the invention has low cost, simple operation and preservation of plant material recovery fast, life etc., mass production to seedling in need, can get a large number of Plantlets in the short term, for the preservation and propagation production to solve urgently germplasm resources were also has the extremely important value.

【技术实现步骤摘要】
一种海伦兜兰原球茎的低温保存培养基及低温保存繁殖方法
：本专利技术属于植物组织培养领域，具体涉及一种海伦兜兰原球茎的低温保存培养基及低温保存繁殖方法。
技术介绍
：海伦兜兰(PaphiopedilumhelenaeAver.)又称巧花兜兰，分布于我国广西西部和越南北部，生长在灌木丛生的石灰岩山地岩壁缝隙中，分布范围狭窄，是一种十分珍稀的兜兰属植物；同时，由于其生境的破坏和人工采挖，其野生植物数量已极为稀少，被《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)列入附录I而禁止交易，被世界自然保护联盟(IUCN)红色名录中列为极危物种(CR)亟待保护，在中国也已被中国国家林业局列为极小种群野生植物需要重点保护。原球茎离体低温保护是海伦兜兰种质资源保护的最有效的方法之一。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种保存成本低、操作简单、植物材料复苏快、生活力高的海伦兜兰原球茎的低温保存培养基及低温保存繁殖方法。本专利技术的第一个目的是提供一种海伦兜兰原球茎的低温保存培养基，其特征在于，每升培养基含有椰子汁50～100毫升、活性炭2.0～3.0克、蔗糖5-10克、琼脂7～8克，其余为1/8MS培养基。本专利技术的第二个目的是提供一种海伦兜兰原球茎低温保存繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)原球茎的获得：选择生长健壮的海伦兜兰母株进行异株人工授粉，将授粉后120～180天的蒴果进行消毒处理，切开果实，将粉末状种子接种到种子萌发培养基上培养，培养温度25～30℃，光照度100～200勒克斯，光照时间12～16小时/天，胚萌发形成原球茎，所述的种子萌发培养基为：每升培养基含有椰子汁50～100毫升、活性炭1.0～2.0克、蔗糖20～30克、琼脂6～7克，其余为1/4MS培养基，pH5.8～6.0；(2)原球茎离体低温保存：将原球茎转移至低温保存培养基中，培养温度15～20℃，光照度50～100勒克斯，光照时间10～12小时/天，所述的低温保存培养基为：每升培养基含有椰子汁50～100毫升、活性炭2.0～3.0克、蔗糖5-10克、琼脂7～8克，其余为1/8MS培养基，pH5.8～6.0；(3)原球茎的恢复生长：将低温保存的原球茎转移至恢复生长培养基中，培养温度25～30℃，光照度100～200勒克斯，光照时间12～16小时/天，原球茎分化出小苗，所述的恢复生长培养基为：每升培养基含有萘乙酸1.0～2.0毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1.0～2.0克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖20～30克、琼脂6～7克，其余为1/4MS培养基，pH5.8～6.0；(4)生根壮苗培养：将小苗接种到壮苗培养基中，培养温度25～30℃，光照度1600～2000勒克斯，光照时间12～16小时/天，获得完整植株，所述的壮苗培养基为：每升培养基含有花宝1号1～2克、花宝2号1～2克、MS培养基的维生素和肌醇成分、萘乙酸1.0～2.0毫克、椰子汁100～200毫升、蛋白胨1～2克、香蕉匀浆50～150克、活性炭1.0～2.0克、蔗糖20～30克、琼脂6～7克，余量为水，pH5.8～6.0。步骤(1)所述的消毒处理具体为：将授粉后120～180天的蒴果用体积分数75％的酒精浸泡60秒后，用质量分数0.1％的升汞溶液消毒20分钟，无菌水冲洗4～5次。步骤(1)～步骤(3)所述的光照的光源为LED光源，所述的LED光源中红光和蓝光的比例为8:1，步骤(4)所述的光照的光源为日光灯。MS培养基为国际通用的培养基，其成分和配制方法参看文献(谭文澄、戴策刚主编.观赏植物组织培养技术.北京：中国林业出版社，1991.)；1/4MS培养基是指将MS培养基中大量元素用量为原来的1/4，其余成份不变；1/8MS培养基是指将MS培养基中大量元素用量为原来的1/8，其余成份不变。所述的1/4MS培养基和1/8MS培养基均为液体培养基，不含有琼脂。本专利技术的海伦兜兰原球茎低温保存繁殖方法，由无菌播种获得原球茎、采用独特的培养基和培养条件进行原球茎离体低温保存、原球茎的恢复生长及生根壮苗四个步骤完成。本专利技术的方法具有保存成本低、操作简单、植物材料复苏快、生活力高等优点，在需要进行种苗的大规模生产时，能在短期内获得大量的试管苗，对于解决快繁生产急用及种质资源的保存也均具有极其重要的价值。在目前，国内外还没有海伦兜兰原球茎离体低温保存繁殖方法的报道。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1：(1)原球茎的获得在温室中选择生长健壮的海伦兜兰(PaphiopedilumhelenaeAver.)母株进行异株人工授粉，然后选择授粉后120天的果实中和胚为外植体进行无菌播种。播种时，将授粉后120天的蒴果用体积分数75％的酒精浸泡60秒后，用质量分数0.1％的升汞溶液中消毒20分钟，无菌水漂洗5次后切开果实，将粉末状种子接种到种子萌发培养基上培养，培养温度25℃，光照度100勒克斯(lux)，光源为LED光源，LED光源中红光和蓝光的比例为8:1，光照时间16小时/天，60天胚萌发形成原球茎，萌发率30％，所述的种子萌发培养基为：每升培养基含有椰子汁50毫升、活性炭1.0克、蔗糖20克、琼脂6克，其余为1/4MS培养基，pH5.8；其配制方法是将50毫升椰子汁、1.0克活性炭、20克蔗糖和6克琼脂，加到少量1/4MS培养基(液体)中，然后用1/4MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。(2)原球茎离体低温保存将萌发获得的原球茎转移至低温保存培养基中，培养温度15℃，光照度50勒克斯(lux)，光源为LED光源，LED光源中红光和蓝光的比例为8:1，光照时间12小时/天，12个月少量原球茎发育成小苗，不会死亡。如需继续保存可将保存的原球茎转移至新的低温保存培养基中继续保存。所述的低温保存培养基为：每升培养基含有椰子汁50毫升、活性炭2.0克、蔗糖5克、琼脂7克，其余为1/8MS培养基，pH5.8；其配制方法是将50毫升椰子汁、2.0克活性炭、5克蔗糖和7克琼脂，加到少量1/8MS培养基(液体)中，然后用1/8MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。(3)原球茎恢复生长将低温保存的原球茎转移至恢复生长培养基中，培养温度25℃，光照度100勒克斯(lux)，光源为LED光源，LED光源中红光和蓝光的比例为8:1，光照时间16小时/天，3个月能分化出小苗，所述的恢复生长培养基为：每升培养基含有萘乙酸1.0毫克、椰子汁100毫升、蛋白胨1.0克、活性炭1.0克、蔗糖20克、琼脂6克，其余为1/4MS培养基，pH5.8；其配制方法是将1.0毫克萘乙酸、100毫升椰子汁、1.0克蛋白胨、1.0克活性炭、20克蔗糖和6克琼脂，加到少量1/4MS培养基(液体)中，然后用1/4MS培养基(液体)补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。(4)生根壮苗培养将1-2cm的小苗接种到壮苗培养基中，培养温度25℃，光照度1600勒克斯(lux)，光源为日光灯，光照时间16小时/天，3个月能形成株高3厘米高的完整植株。采用标准兰花培养瓶，每瓶25株。所述的壮苗培养基为：每升含有花宝1号1克、花宝2号1克、MS培养基的维生素和肌醇成分(盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5毫本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种海伦兜兰原球茎的低温保存培养基，其特征在于，每升培养基含有椰子汁50～100毫升、活性炭2.0～3.0克、蔗糖5‑10克、琼脂7～8克，其余为1/8MS培养基。

【技术特征摘要】
1.一种海伦兜兰原球茎的低温保存培养基，其特征在于，每升培养基含有椰子汁50～100毫升、活性炭2.0～3.0克、蔗糖5-10克、琼脂7～8克，其余为1/8MS培养基。2.一种海伦兜兰原球茎低温保存繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)原球茎的获得：选择生长健壮的海伦兜兰母株进行异株人工授粉，将授粉后120～180天的蒴果进行消毒处理，切开果实，将粉末状种子接种到种子萌发培养基上培养，培养温度25～30℃，光照度100～200勒克斯，光照时间12～16小时/天，胚萌发形成原球茎，所述的种子萌发培养基为：每升培养基含有椰子汁50～100毫升、活性炭1.0～2.0克、蔗糖20～30克、琼脂6～7克，其余为1/4MS培养基，pH5.8～6.0；(2)原球茎离体低温保存：将原球茎转移至低温保存培养基中，培养温度15～20℃，光照度50～100勒克斯，光照时间10～12小时/天，所述的低温保存培养基为：每升培养基含有椰子汁50～100毫升、活性炭2.0～3.0克、蔗糖5-10克、琼脂7～8克，其余为1/8MS培养基，pH5.8～6.0；(3)原球茎的恢复生长：将低温保存的原球茎转移至恢复生长培养基中，培养温度25～30℃，光照度100～200勒克斯，光照时间12～16小时/天...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宋君，张雪莲，文颖婷，吴坤林，郑枫，张建霞，张新华，马国华，段俊，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：广东,44