一种基于牛乳外泌体制造技术

本发明专利技术公开了一种基于牛乳外泌体

【技术实现步骤摘要】
一种基于牛乳外泌体miRNA相对定量检测的奶牛早期妊娠诊断方法


[0001]本专利技术涉及一种基于牛乳外泌体
miRNA
相对定量检测的奶牛早期妊娠诊断方法
。

技术介绍

[0002]近些年来，奶牛业的发展受到了限制，主要原因是母牛繁殖力较低
。
在第二个发情周期到来之前不能准确判断母牛是否发生妊娠，从而延长了产犊间隔，这是导致母牛繁殖力低下的主要原因
。
因此，准确及时的早期妊娠诊断对于提高母牛的繁殖力具有至关重要的作用
。
早期妊娠诊断可以尽早发现空怀牛并对其进行转群管理和再次人工授精，可以缩短产犊间隔
、
减少因空怀而延长产犊间隔
、
降低产奶量等造成的经济损失
。
国外报道，一头奶牛每减少一天空怀，就可增加2美元的经济效益，同时据国内统计，每延误一个发情周期
(21d
左右
)
，每头奶牛的产奶量将减少
168
‑
315kg。
目前，我国奶牛早期妊娠诊断技术尚未成熟，尤其是目前与现代规模化
、
标准化
、
产业化养殖技术相匹配的批量化的现场检测技术越来越引起产业的关注
。
因此，探究一种快速
、
准确且低成本的早期妊娠诊断方法是十分重要的
。
[0003]在妊娠期间，妊娠母牛和非妊娠母牛的机体在授精后会发生不同的新陈代谢变化，繁殖相关的生理生化指标产生差异，如生殖器官特征
、
孕酮浓度
、
妊娠相关糖蛋白的含量和体温等
。
已有的早期妊娠诊断方法都是基于这些指标差异发展起来的
。
目前，在生产中最基本且可靠的方法是直肠触诊法，主要根据触摸和感受生殖器官的形态变化来判断，该方法通常在人工授精后
45
‑
50d
可以做出判断，经验丰富的工作人员可以在配种后
35d
判断母牛是否妊娠
。
通过超声波检查法也可以对奶牛的妊娠状态做出诊断，该方法在配种后
30d
进行诊断
。
通过放射免疫检测法和酶联免疫测定法检测奶牛外周血中妊娠相关糖蛋白的浓度可以在配种后
28d
诊断奶牛是否妊娠，准确率可达
90
％以上，未发现在
21d
内的诊断结果
。
利用孕酮进行妊娠诊断主要有放射免疫检测法和酶联免疫测定法等方法，该方法敏感性和准确率较高
。
但仅能够在
22
‑
26d
内进行诊断
。
综上所示，已知的早期妊娠诊断方法均不能在人工授精后三周内做出判断，意味着将错过第二个发情周期，导致产犊间隔延长，造成经济损失
。
研究表明，在人工授精后三周内进行准确的早期妊娠诊断，筛查空怀母牛，即可对其进行同期发情处理，在配种后
21
‑
23d
进行再次人工授精
。
因此，在奶牛配种后
21d
内判断其是否妊娠是提高奶牛繁殖力的关键
。

技术实现思路

[0004]本专利技术在于针对目前奶牛早期妊娠诊断存在的诊断时间晚
、
采样不便等缺点，提供一种基于牛乳外泌体
miRNA
相对定量检测的奶牛早期妊娠诊断方法，能够利用牛乳进行检测，将准确判断奶牛妊娠状态的时间提前至
15d。
[0005]实现上述检测方法的步骤如下：
[0006](1)
牛乳样本的采集
[0007]奶牛同期发情后，采集人工授精后当天
、
人工授精后第
15
天的牛乳
1000mL
，
‑
80℃
储存
。
[0008](2)
牛乳外泌体的提取
[0009]将
50mL
牛乳以
2 000
×
g
的重力离心
15min
，收集中间层并重复两次，使用
10
％冰乙酸溶液将
pH
调至6，每毫升牛乳加入
0.035mg
凝乳酶，用1％
NaCl
溶液溶解，并置于
37℃
水浴
30min
，活化后加至牛乳中，置于
37℃
水浴
30
‑
35min
，
12 000
×
g
离心
30min
，收集乳清并
12 000
×
g
离心
1h
，使用
0.45
μ
m
滤器过滤，滤过液以
75 000
×
g
的重力离心
1h
，再使用
0.22
μ
m
滤器过滤，滤过液以
150 000
×
g
的重力离心
2h
，收集底部沉淀
。
[0010](3)
外泌体
RNA
的提取
[0011]获取的外泌体用
Trizol
法提取总
RNA
，并用
NanoDrop 2000
分析
RNA
样本的浓度，
OD260/280
＝
1.8
‑
2.0
，提取后的
RNA
储存于
‑
80℃
备用
。
[0012](4)miRNA
逆转录反应
[0013]miRNA
逆转录采用
miRNA cDNA
第一链合成试剂盒完成，每个反应的
RNA
用量为
1000ng
，根据试剂盒说明书和
RNA
浓度配制每个反应混合液
。
[0014](5)
荧光定量
PCR
检测
bta
‑
miR
‑
30d、bta
‑
miR
‑
26a
和
bta
‑
miR
‑
30a
‑
5p
在牛乳中的相对表达量
。
[0015]1)
引物序列的设计和合成
[0016]牛
bta
‑
miR
‑
30d、bta
‑
miR
‑
26a、bta
‑
miR
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于牛乳外泌体
miRNA
相对定量检测的奶牛早期妊娠诊断方法，包括牛
bta
‑
miR
‑
30d、bta
‑
miR
‑
26a、bta
‑
miR
‑
30a
‑
5p
和内参基因
U6
引物对
。2.
根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述试剂盒的统一浓度和1人份测试用量统一标准为：
bta
‑
miR
‑
30d
‑
F:TGTAAACATCCCCGACTGGAAGCT 10
μ
mol/L 0.5
μ
Lbta
‑
miR
‑
26a
‑
F:TTCAAGTAATCCAGGATAGGCT 10
μ
mol/L 0.5
μ
Lbta
‑
miR
‑
30a
‑
5p
‑
F:TGTAAACATCCTCGACTGGAAGCT 10
μ
mol/L 0.5
μ
L
通用引物
‑
R:AGTGCAGGGTCCGAGGTATT 1.5
μ
LU6
‑
F:GCTTCGGCAGCACATATACT 10
μ
mol/L 0.5
μ
L。3.
根据权利要求1和2所述，一种基于牛乳外泌体
miRNA
相对定量检测的奶牛早期妊娠诊断方法，包括如下步骤：
(1)
牛乳样本的采集奶牛同期发情后，采集人工授精后当天
、
人工授精后第
15
天的牛乳
1000mL
，
‑
80℃
储存
。(2)
牛乳外泌体的提取将
50mL
牛乳以
2 000
×
g
的重力离心
15min
，收集中间层并重复两次，使用
10
％冰乙酸溶液将
pH
调至6，每毫升牛乳加入
0.035mg
凝乳酶，用1％
NaCl
溶液溶解，并置于
37℃
水浴
30min
，活化后加至牛乳中，置于
37℃
水浴
30
‑
35min
，
12 000
×
g
离心
30min
，收集乳清并
12 000
×
g
离心
1h
，使用
0.45
μ
m
滤器过滤，滤过液以
75 000
×
g
的重力离心
1h
，再使用
0.22
μ
m
滤器过滤，滤过液以
150 000
×

【专利技术属性】
技术研发人员：江中良，刘光宇，孙小琴，梁明月，吕静，
申请(专利权)人：刘光宇，
类型：发明
国别省市：