一种口蹄疫液相阻断制造技术

本发明专利技术专利公开了一种口蹄疫液相阻断

【技术实现步骤摘要】
一种口蹄疫液相阻断ELISA试验样品布局检测方法


[0001]本专利技术专利涉及兽医实验室检测
，具体涉及口蹄疫液相阻断
ELISA
试验
。

技术介绍

[0002]口蹄疫
(FMD)
是由口蹄疫病毒
(FMDV)
引起的家畜的一种急性
、
热性
、
高度接触性传染病，是当今世界上最为严重的传染病，主要感染牛
、
羊
、
猪等偶蹄类动物，严重危害畜牧业健康发展和国际畜产品的对外贸易，我国将其列为一类动物疫病，并将其作为强制免疫的动物疫病病种，为了科学评价
O
型口蹄疫疫苗的免疫效果，目前，最常用的抗体检测方法是液相阻断试验，现有液相阻断
ELISA
试验样品布局为每板
10
份和
20
份2种布局，大批量检测时，即费时又费钱，为了节省时间和试剂盒费用，采用每板
40
份样品布局更经济适用
。
本专利技术建立液相阻断
ELISA
试验每板
40
份样品布局检测方法，并通过与每板
10
份和
20
份样品布局检测方法结果进行比较，判定结果完全准确
。

技术实现思路

[0003]试剂
O
型口蹄疫液相阻断
ELISA
试剂盒，批号：
20201013101
‑5，中国农业科学院兰州兽医研究所生产
。
[0004]试验方法器材准备移液器；抗原抗体反应板；无离子水或蒸馏水
。
[0005]试剂准备磷酸盐
‑
吐温缓冲液
(PBST)
：试验操作前，将试剂盒配备的
25
倍的
PBST 浓缩液用无离子水或蒸馏水稀释成1倍
PBST(1
份浓缩液加入
24
份水进行稀释
)
，进行洗板或血清和病毒抗原的稀释
。
[0006]操作步骤抗原抗体
(
阴阳性对照血清及待检血清
)
反应：表
1 O
型口蹄疫液相阻断
ELISA
试验
40
份布局稀释血清以表1为例操作，在
U
型反应板上以
160
μ
l/
孔的量用
PBST 2
倍连续稀释血清，每份血清稀释
1∶32
和
1∶642
孔，
(
先在
A、C、E、G
行的1‑
10
孔各加
PBST 155
μ
l
，
B、D、F、 H
行的1‑
10
孔各孔加
PBST 80
μ
l
，再在
A、C、E、G
行的1‑
10
孔按顺序加被检血清5μ
l
，做2倍稀释
)
，在第
11
列稀释阳性对照血清，从
1∶2(
即
A11
孔
80
μ
l PBST
加
80
μ
l
阳性对照血清
)
稀释至
1∶256
；
A12
～
B12
孔稀释阴性对照血清，从
1∶2
稀释至
1∶4
；
E12
～
H12
孔为病毒抗原对照孔
。
[0007]加病毒抗原：将病毒抗原用
PBST
稀释至工作浓度，以
80
μ
l/
孔的量加入到被检血清
、
阴阳性对照血清的每一稀释孔内，4孔病毒抗原对照孔仅加入
100
μ
l/
孔稀释至工作浓度
的病毒抗原
。
加入相应病毒抗原后，血清的稀释度加倍，被检血清变成
1∶64
和
1∶128
，由于阳性对照血清已经预先作了8倍稀释，则变为
1∶32
～
1∶4096。
封板，震荡，
4℃
静置过夜或
37℃
温育
90min。
[0008]将抗原抗体混合液从
U
型反应板上按次序转移至已包被口蹄疫
O
型兔抗的
ELISA
板上，
50
μ
l/
孔，封板，
37℃
温育
60min。
[0009]用
PBST
连续洗板3～5次，拍干，按
50
μ
l/
孔加口蹄疫
O
型豚鼠抗体工作液
(
红色
)
，封板，
37℃
温育
30min。
[0010]同上洗板3～5次，拍干，按
50
μ
l/
孔加兔抗豚鼠
IgG
‑
HRP
工作液
(
蓝色
)
，封板，
37℃
温育
30min。
[0011]同上洗板3～5次，拍干，将
TMB
底物
A
溶液和
B
溶液以
1∶1
比例混匀，加入混匀的底物溶液
50
μ
l/
孔，置
37℃
显色
15min。
[0012]显色反应结束后，加终止液
50
μ
l/
孔，终止反应，在酶标仪上读取
D450nm
值
。
[0013]结果判定试验认可标准每块板设4孔病毒抗原对照，病毒抗原对照
D450nm
值应在
1.0
以上，阳性对照抗体效价应在
1∶1024
±1滴度以内，阴性对照血清抗体效价应＜
1∶8。
[0014]血清抗体效价的判定病毒抗原对照4孔，弃去最高和最低
D450nm
值，计算剩余2孔的平均
D450nm
值，再除以2，即
50
％对照值
。
该值即为临界值，表示阻断
50
％反应的对照 D450nm
值
。
被检血清
D450nm
值大于临界值的孔为阴性孔，小于等于临界值的孔阳性孔
。
若临界值于稀释倍数最高阳性孔的
D450nm...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
为了科学评价
O
型口蹄疫疫苗的免疫效果，目前，最常用的抗体检测方法是液相阻断试验，现有液相阻断
ELISA
试验样品布局为每板
10
份和
20
份2种布局，大批量检测时，即费时又费钱，为了节省时间和试剂盒费用，采用每板
...

【专利技术属性】
技术研发人员：王拴成，张琴，
申请(专利权)人：张琴，
类型：发明
国别省市：