2-制造技术

本发明专利技术提供了一种2‑

【技术实现步骤摘要】
2
‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺的检测方法


[0001]本专利技术涉及化合物分析技术，具体地说，涉及2‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺的检测方法
。

技术介绍

[0002]2‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺是一种在合成寡核苷酸中应用非常广泛的亚磷酰胺试剂
。
寡核苷酸化学合成的主要挑战是活化
3'
‑
OH(
或
5'
‑
OH)
，使下一个核酸单元能够在较为温和的条件下逐次添加到寡核苷酸链上
。
历史上，科学家尝试过使用许多不同的活化基团，经过不断的优化，在
20
世纪
80
年代初开发出以亚磷酰胺作为
3'
‑
OH
活化基团的合成法，并成功实现了固相合成和自动化合成
。
[0003]2‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺性质不稳定，对空气
、
湿气敏感，容易氧化或水解，且价格较高，所以研究人员经常现场制备这种磷试剂，并以溶液形式存放和随后投料使用，以便保证磷试剂的质量，并具有较大的成本优势
。
通常情况下，研究人员自己制备的磷试剂的溶液需要对其含量进行准确的测定，因为合成寡核苷酸单体时，需要准确测定磷试剂的含量用于计算投料比，一旦磷试剂使用过量，会在单体合成时产生杂质，从而影响寡核苷酸单体的质量
。
目前关于溶液中磷试剂含量的检测的方法报道非常少，大多以
NMR
作为检测手段，利用待测物和内标物的特征峰峰面积的比例计算磷试剂的含量，例如，
CN106132973A、CN103087096A、CN11123392
，
Large
‑
scale synthesis of high purity“Phosreagent”useful for oligonucleotidetherapeutics,R.Gukathasan et al.,Journal of Organometallic Chemistry 690(2005)2603
–
2607
，均公开了通过
31
PNMR
测定亚磷酰二胺的含量，但
NMR
本身费用昂贵且维护成本高，许多医药公司未配备
NMR
，无法实现用
NMR
检测磷试剂的含量
。
而且2‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺本身几乎无紫外吸收，且对空气
、
水等均不稳定，因此也无法采用常规的反相液相色谱进行检测
。
[0004]因此，亟需开发一个易实现
、
重复性好
、
准确度高的分析方法用于2‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺的检测，例如，检测样品中2‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺的含量
。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中2‑
氰乙基
‑
N,N,N',N'
‑
四异丙基亚磷酰二胺的检测方法存在成本高，操作不易实现等缺陷，本专利技术提供了一种简单
、
快速
、
易实现的2‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺的检测方法，解决了目前常规液相色谱难以直接检测磷试剂的技术问题
。
为实现本专利技术的目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0006]一种2‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
[0007](1)
将待测样品进行前处理得到待测溶液，其中前处理使得待测样品中的2‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺衍生化成为式
I
所示化合物，
[0008][0009]其中，
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7各自独立地为氢
、
卤素
、C1‑
C3烷基
、C1‑
C3卤代烷基
、C1‑
C3烷氧基
、
苯氧基
、
硝基
、
氰基
、
酰胺基，
[0010](2)
利用高效液相色谱检测待测溶液中的2‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺的衍生产物，通过外标法，得到待测溶液中衍生产物的浓度，
[0011](3)
计算得到待测样品中2‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺的含量
。
[0012]在另一优选例中，式
I
中的萘甲基选自下列基团：
[0013][0014]其中
*
代表连接点
。
[0015]在另一优选例中，式
I
中的萘甲基选自其中
*
代表连接点
。
[0016]在另一优选例中，步骤
(1)
中前处理待测样品包括步骤：将待测样品与激活剂和式
III
所示化合物混合，使得待测样品中的式
II
所示的2‑
氰乙基
‑
N,N,N',N'
‑
四异丙基亚磷酰二胺，在激活剂的存在下，与式
III
所示化合物反应，生成式
I
所示化合物，反应式如下：
[0017][0018]在另一优选例中，所述激活剂选自
4,5
‑
二氰基咪唑
。
[0019]在另一优选例中，反应体系中，式
III
所示化合物与式
II
所示化合物的摩尔比为2～
3:1。
[0020]在另一优选例中，反应体系中，激活剂与式
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.2
‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
(1)
将待测样品进行前处理得到待测溶液，其中前处理使得待测样品中的2‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺衍生化成为式
I
所示化合物，其中，
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7各自独立地为氢
、
卤素
、C1‑
C3烷基
、C1‑
C3卤代烷基
、C1‑
C3烷氧基
、
苯氧基
、
硝基
、
氰基
、
酰胺基，
(2)
利用高效液相色谱检测待测溶液中的2‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺的衍生产物，通过外标法，得到待测溶液中衍生产物的浓度，
(3)
计算得到待测样品中2‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺的含量
。2.
根据权利要求1所述的2‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺的检测方法，其特征在于，式
I
中的萘甲基选自下列基团：其中
*
代表连接点，更佳地，式
I
中的萘甲基选自其中
*
代表连接点
。3.
根据权利要求1或2所述的2‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺的检测方法，其特征在于，步骤
(1)
中前处理待测样品包括步骤：将待测样品与激活剂和式
III
所示化合物混合，使得待测样品中的式
II
所示的2‑
氰乙基
‑
N,N,N',N'
‑
四异丙基亚磷酰二胺，在激活剂的存在下，与式
III
所示化合物反应，生成式
I
所示化合物，反应式如下：
较佳地，所述激活剂选自
4,5
‑
二氰基咪唑
。4.
根据权利要求3所述的2‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺的检测方法，其特征在于，反应体系中，式
III
所示化合物与式
II
所示2‑
氰乙基
‑
N,N,N',N'
‑
四异丙基亚磷酰二胺的摩尔比为2～
3:1
，和
/
或反应体系中，所述激活剂与2‑
氰乙基
‑
N,N,N',N'
‑
四异丙基亚磷酰二胺的摩尔比为1～
3:1
，和
/
或反应体系的反应的温度为4～
40℃。5.
根据权利要求1或2所述的2‑
氰乙基
‑
N,N,N
’
,N
’‑
四异丙基亚磷酰二胺的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测中，所用检测波长为
280nm
±
4nm
；所用色谱柱为
C8
柱或
C18
柱；流动相由乙酸铵溶液和乙腈组成，以浓度为
5mmol/L
～
50mmol/L
的乙酸铵水溶液为流动相
A
，以乙腈为流动相
B
，梯度洗脱程序为：0～
3min
，
10
％
B
；3～
10min
，
10
％
B
→
50
％
B
；
10
～
20min
，
50
％
B
→
90
％
B
；
20
～
2...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊志刚，王彩杰，杨国涛，陈佳正，邢玉海，张为苏，崔连成，郭万成，
申请(专利权)人：上海奥锐特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：