表达系统及其构建方法和应用技术方案

本申请涉及一种表达系统及其构建方法和应用，该表达系统包括

【技术实现步骤摘要】
表达系统及其构建方法和应用


[0001]本申请涉及合成生物技术和基因工程领域，具体涉及一种表达系统及其构建方法和应用
。

技术介绍

[0002]质粒是一类独立于染色体的可自主复制的遗传因子，在代谢工程研究中被广泛用于目标基因的过表达
。
相比于基因组整合表达，利用人工质粒表达目标基因具有操作简单
、
拷贝数高
、
目标基因表达量高等优点
。
然而，目前人工开发的质粒载体经常存在不稳定性问题，即重组菌在培养过程中丢失质粒而失去原有的表型特征，进而造成发酵生产不稳定
。
多数人工质粒都携带有抗生素抗性基因，在实验室发酵过程中添加相应抗生素，可以维持质粒稳定；然而在工业发酵中，抗生素的添加不仅极大地增加成本，而且会限制特定发酵产品的使用范围
。
再者，抗生素的滥用存在生态安全方面的隐患，可能导致超级耐药菌的出现
。
因此，开发不依赖于抗生素筛选压力的质粒稳定表达系统，具有重要的应用价值
。
[0003]研究者已开发了一些维持质粒稳定传代的方法
。
比如，利用毒素
‑
抗毒素系统（如
parD
和
parE
），或者利用操纵子
‑
阻遏蛋白中和系统（即
Operator
‑
repressor titration, ORT
）
。
但这些方法会增加细胞的生理负担，导致生长减慢以及影响目标产品的合成
。
也有部分研究者也尝试敲除基因组上的
infA、ispH
和
lpxA
等，再采用质粒进行回补表达，可使细胞的生长依赖于质粒的存在，从而保证质粒稳定传代
。
然而目前已报道的这些基因在采用质粒表达时，多拷贝质粒往往导致表达量上调，反过来导致细胞代谢不平衡，或者负反馈调节降低质粒的拷贝数，从而影响重组菌株的目标产品生产效率
。

技术实现思路

[0004]基于此，本申请提供
nadK
基因用于构建一种表达系统，利用该系统可实现载体不依赖于抗生素选择性压力而稳定遗传，此外，
nadK
基因在该表达系统的过表达不会导致细胞代谢负担加重
、
甚至可促进目标代谢产物的合成，对于以微生物为细胞工厂
、
采用合成生物技术高产目标代谢产物非常重要
。
[0005]具体技术方案如下：一种表达系统，所述表达系统包括
nadK
基因缺失型宿主细胞和表达载体，所述
nadK
基因缺失型宿主细胞中含有所述的表达载体；所述表达载体包括
nadK
基因
。
[0006]在其中一个实施例中，所述表达载体还包括目的基因
。
[0007]一种表达系统的构建方法，包括如下步骤：将上述表达载体转化至宿主细胞；及敲除所述宿主细胞基因组上
nadK
基因
。
[0008]nadK
基因在构建载体稳定的表达系统中的应用
。
[0009]所述的表达系统在外源蛋白如外源酶表达，或目标代谢产物合成中的应用
。
[0010]相对于传统技术，本申请具备如下有益效果：
本申请基于
nadK
基因开发了一种载体稳定表达系统，既可以提高在不添加抗生素的条件下宿主细胞中载体的传代稳定性；又可促进外源蛋白或外源酶的表达，以及目标代谢产物的合成
。
进一步将上述的表达系统用于外源蛋白或外源酶的稳定高表达，以及各种目标代谢产物的合成
。
附图说明
[0011]图1为携带
nadK
基因的质粒
pET32a
‑
PnhM
‑
mcherry
‑
nadK
的构建示意图；图2为重组大肠杆菌
VG1
△
nadK(pET32a
‑
PnhM
‑
mcherry
‑
nadK)
的构建示意图；图3为重组大肠杆菌
VG1
△
nadK(pET32a
‑
PnhM
‑
mcherry
‑
nadK)
与
VG1(pET32a
‑
PnhM
‑
mcherry)
的质粒稳定性对比；图4为重组大肠杆菌
VG1
△
nadK(pET32a
‑
PnhM
‑
mcherry
‑
nadK)
与
VG1(pET32a
‑
PnhM
‑
mcherry)
的荧光强度对比；图5为重组大肠杆菌
VG1
△
nadK(pTU14
‑
nadK)
与
VG1(pTU14)
的质粒稳定性对比；图6为重组枯草芽孢
THY7
△
nadK(pHT08
‑
Pg3
‑
lacZ
‑
nadK)
与
THY7 (pHT08
‑
Pg3
‑
lacZ)
的质粒稳定性对比；图7为重组红色红球菌
THdAdN
△
nadK(pNVSm
‑
SBMDB
‑
nadK)
与
THdAdN(pNVSm
‑
SBMDB)
的质粒稳定性对比；图8为重组谷氨酸棒杆菌
ATCC13032
△
nadK(pXMJ19
‑
Ptac
‑
ssehasA
‑
hasB
‑
nadK)
与
ATCC13032 (pXMJ19
‑
Ptac
‑
ssehasA
‑
hasB)
的质粒稳定性对比
。
具体实施方式
[0012]为使本申请的上述目的
、
特征和优点能够更加明显易懂，下面对本申请的具体实施方式做详细的说明
。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请
。
但是本申请能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下做类似改进，因此本申请不受下面公开的具体实施例的限制
。
[0013]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的
的技术人员通常理解的含义相本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种表达系统，其特征在于，所述表达系统包括
nadK
基因缺失型宿主细胞和表达载体，所述
nadK
基因缺失型宿主细胞中含有所述的表达载体；所述表达载体包括
nadK
基因
。2.
根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述表达载体还包括目的基因
。3.
根据权利要求1或2所述的表达系统，其特征在于，所述表达载体为质粒
。4.
根据权利要求3所述的表达系统，其特征在于，所述质粒包括
pUC
系列
、pET
系列
、pNV
系列和
pXMJ19
及其衍生质粒
。5.
根据权利要求4所述的表达系统，其特征在于，所述质粒包括
pUC19、pET32a、pNV18、pXMJ19
及其衍生质粒
。6.
根据权利要求
1~2
及
4~5
任一项所述的表达系统，其特征在于，所述目的基因包括目标代谢产物合成相关基因
。7.
根据权利要求
1~2
及
4~5
任一项所述的表达系统，其特征在于，所述目的基因包括荧光报告基因
、
腈水合酶基因
、
β
‑
半乳糖苷酶基因
、
透明质酸合成的相关基因或
PHA
合成的相关基因
。8.
根据权利要求
1~2
及
4~5
任一项所述的表达系统，其特征在于，所述
nadK
基因的来源包括大肠杆菌
、
枯草芽孢杆菌
、
红球菌或者谷氨酸棒杆菌
。9.
根据权利要求8所述的表达系统，其特征在于，所述
nadK
基因的核苷酸片段选自
SEQ ID NO:1~5
所示片段中的任意一种
。10.
根据权利要求
1~2、4~5
及9任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：于慧敏，梁有向，王苗苗，宋凌伟，
申请(专利权)人：北京衍微科技有限公司，
类型：发明
国别省市：