一种用于血清中胰岛素和制造技术

一种用于血清中胰岛素和

【技术实现步骤摘要】
一种用于血清中胰岛素和C肽检测的免疫生物芯片的制备方法


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种用于血清中胰岛素和
C
肽检测的免疫生物芯片的制备方法
。

技术介绍

[0002]体内胰岛素和
C
肽的检测方法可概括为免疫检测方法和非免疫检测方法
。
免疫检测方法包括电化学发光法
(ECL)、
放射免疫分析法
(RIA)
和酶联免疫分析法
(ELISA)
等；非免疫检测方法包括同位素稀释法
、
高效液相色谱法
、
质谱法等
。
这些方法目前都依赖于专业的检测设备和检验人员，且需要较多的血清才能完成检测，难以实现居家监测
。
[0003]与其他光谱技术和传统拉曼光谱技术相比，表面增强拉曼散射技术
(SERS)
具有超灵敏
、
快速
、
无损
、
多路复用等特点，即使在复杂的生物环境中也能轻松识别目标物质
。
目前，普遍认为
SERS
的增强机制包括电磁场增强和化学增强
。
金属纳米颗粒和金属氧化物等经常被报道为
SERS
纳米材料，其中金属纳米颗粒对
SERS
有很强的化学增强作用
。
多项研究制备了各种
AuNRs@Ag、AuNRs@Pt(
钯
)
等纳米复合材料，证明金属纳米颗粒可以实现较强的
SERS
增强
。
[0004]表面增强拉曼散射
(Surface
‑
enhancedRaman scattering
，
SERS)
光谱具有光谱带窄
、
灵敏度高
、
多通道检测的优点，结合免疫检测技术，可以应用于蛋白质
、
病毒
、
细菌等的检测
。
目前，基于
SERS
的免疫检测技术通常依赖于液态
SERS
免疫磁珠基底
、
固态
SERS
免疫芯片基底和
SERS
免疫层析基底
。
在国内外的研究中，用于制备
SERS
免疫磁珠的磁性纳米颗粒包括银壳磁珠
、
金壳磁珠以及普通的羧基化磁珠
。
基于免疫磁珠的
SERS
免疫检测一般可实现单通道和双通道检测
。
而固态
SERS
免疫芯片基底由于具有预定义的多个孔阵列，可实现多通道检测
。SERS
‑
免疫层析技术是以条状纤维层析膜为固相基底
、
将
SERS
检测探针与免疫层析技术相结合的快速
、
高灵敏免疫分析方法，但也较难实现多通道和集成化检测
。
[0005]基于金
、
银的纳米材料因其制备方便
、
增强效果显著而成为
SERS
平台研究的热点，金纳米棒因其良好的生物相容性而适合于生物医学领域的检测
、
荧光成像和光热治疗等
。
尽管
AuNRs
具有出色的拉曼性能，但由于其合成过程中不可或缺的成分
——
表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵
(CTAB)
的存在，
CTAB
会在
AuNRs
表面形成强边界和带正电荷的双分子层，使
AuNRs
在生物传感方面的应用受到限制
。SERS
在各种超灵敏分析中的优异表现主要归功于其强大的信号增强能力
。
多种基于
SERS
的分析方法被开发用于生物分析，在这些基于
SERS
的方法中，构建和制备纳米材料作为拉曼探针对于实现高可靠性的检测结果至关重要
。
目前，已有多种纳米材料被构建并应用于生物分子的检测
。
然而，这些纳米材料在用作
SERS
平台时，大多需要特定的分子修饰，这将使这些方法变得复杂
。
因此，设计和构建新型纳米材料作为检测生物分子的拉曼平台是必要的
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种用于血清中胰岛素和
C
肽检测的免疫生物芯片的制备方法，该方法制备得到的芯片特异性强，能对磁性基底上吸附的胰岛素抗体或
C
‑
肽抗体特异性识别，能排除其他与胰岛素抗体或
C
‑
肽抗体结构相似物质的干扰，可应用于胰岛素抗体或
C
‑
肽抗体的高效灵敏检测，提升
SERS
的灵敏度和选择性
。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了一种用于血清中胰岛素和
C
肽检测的免疫生物芯片的制备方法，包括如下步骤：
[0008](1)
制备
SERS
探针
@
抗体
[0009](1
‑
1)
向
SERS
探针中加入
EDC
和
NHS
，于室温震荡，最后通过
PBS
洗涤后分散到
PBS
中；
[0010](1
‑
2)
当
SERS
探针为
Au NRs@SiO2@4
‑
MBA@Ag
时，向步骤
(1
‑
1)
制得的溶液中加入的胰岛素抗体；当
SERS
探针为
Au NRs@SiO2@DTNB@Ag
时，向步骤
(1
‑
1)
制得的溶液中加入
C
‑
肽抗体，然后于
4℃
孵育
12h
得到混合溶液；
[0011](1
‑
3)
向步骤
(1
‑
2)
制得的混合溶液中加入3％
BSA
作为封闭液，于
4℃
反应
6h
后离心分散到
PBS
中得到
Au NRs@SiO2@4
‑
MBA@Ag@
胰岛素抗体或
Au NRs@SiO2@4
‑
MBA@Ag@C
‑
肽抗体；
[0012](2)
制备磁性基底
@
抗体：
[0013](2
‑
1)<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于血清中胰岛素和
C
肽检测的免疫生物芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)
制备
SERS
探针
@
抗体
(1
‑
1)
向
SERS
探针中加入
EDC
和
NHS
，于室温震荡，最后通过
PBS
洗涤后分散到
PBS
中；
(1
‑
2)
当
SERS
探针为
Au NRs@SiO2@4
‑
MBA@Ag
时，向步骤
(1
‑
1)
制得的溶液中加入的胰岛素抗体；当
SERS
探针为
Au NRs@SiO2@DTNB@Ag
时，向步骤
(1
‑
1)
制得的溶液中加入
C
‑
肽抗体，然后于
4℃
孵育
12h
得到混合溶液；
(1
‑
3)
向步骤
(1
‑
2)
制得的混合溶液中加入3％
BSA
作为封闭液，于
4℃
反应
6h
后离心分散到
PBS
中得到
Au NRs@SiO2@4
‑
MBA@Ag@
胰岛素抗体或
Au NRs@SiO2@4
‑
MBA@Ag@C
‑
肽抗体；
(2)
制备磁性基底
@
抗体：
(2
‑
1)
将羧基化磁珠分散到
PBS
中，向溶液中加入胰岛素抗体或
C
‑
肽抗体，于
4℃
孵育
12h
得到混合溶液；
(2
‑
2)
向步骤
(2
‑
1)
制得的混合溶液中加入3％
BSA
作为封闭液，于
4℃
反应
6h
，羧基化磁珠磁性分离分散到
PBS
中得到羧基化磁珠
@
胰岛素或羧基化磁珠
@C
‑
肽抗体；
(3)
免疫生物芯片的制备：将步骤
(2)
获得的羧基化磁珠
@
胰岛素或羧基化磁珠
@C
‑
肽抗体加入到
EP
管中，然后加入不同浓度的胰岛素或
C
肽，室温孵育
3h
后磁性分离，并用
PBS
洗涤以去除未结合的抗原；然后将步骤
(1)
制备好的
SERS
探针加入到上述混合溶液中，室温孵育
2h
后磁性分离，并用
PBS
洗涤清洗掉未连接的
SERS
探针，得到用于血清中胰岛素和
C
肽检测的免疫生物芯片
。2.
根据权利要求1所述的一种用于血清中胰岛素和
C
肽检测的免疫生物芯片的制备方法，其特征在于，步骤
(1
‑
2)
中，
AuNRs@SiO2@4
‑
MBA@Ag
或
Au NRs@SiO2@DTNB
的具体制备步骤如下：
a.
制备
AuNRs@SiO2@4
‑
MBA
或
AuNRs@SiO2@DTNB
将
AuNRs
加入到去离子水中，超声分散以均匀混合，置于
30℃
的油浴中搅拌，然后加入
CTAB
，搅拌后再加入
NaOH
，搅拌后加入4‑
MBA
或
DTNB
，搅拌后分三次加入
TEOS
，继续于油浴中反应
24h
后离心，水洗后加入去离子水，储存于
4℃
；
b.
制备
APTES
功能化的
Au NRs@SiO2@4
‑
MBA
或
AuNRs@SiO2@DTNB
将步骤
a
制备的
Au NRs@SiO2@4
‑
MBA
或
Au NRs@SiO2@DTNB
加入到容器中，随后加入无水乙醇和
APTES
，超声以混合均匀后置于
80℃
的油浴中，反应
2h
待自然冷却至室温后离心，弃上清后干燥得到
APTES
功能化的
AuNRs@SiO2@4
‑
MBA
或
APTES
功能化的
Au NRs@SiO2@DTNB
；
c.
制备
AuNRs@SiO2@4
‑
MBA@Ag
或
Au NRs@SiO2@DTNB@Ag
探针将步骤
b
制备的
APTES
功能化的
Au NRs@SiO2@4
‑
MBA
或
APTES
功能化的
Au NRs@SiO2@DTNB
分散到盛有去离子水的容器中，待完全溶解后超声，加入
AgNO3后于室温搅拌，再加入柠檬酸三钠搅拌；将得到的混合溶液转移至离心管中，加入
NaBH4，于室温孵育
12h
后离心，弃上清后分散于去离子水中，得到
Au NRs@SiO2@4
‑
MBA@Ag
或
Au NRs@SiO2@DTNB@Ag
探针
。3.
根据权利要求2所述的一种用于血清中胰岛素和
C
肽检测的免疫生物芯片的制备方法，其特征在于，所述
AuNRs
的制备过程为：
S1、
制备种子液将
HAuCl4·
4H2O
与
CTAB
均匀混合，加入零度以下的
NaBH4，适当超声，于
24
‑
25℃
反应
2h
制备得到种子液；
S2、
制备生长液将
CTAB
加入到容器中，然后置于
25℃
的油浴中搅拌，加入
AgNO3搅拌数秒后加入
HAuCl4·
4H2O
...

【专利技术属性】
技术研发人员：李世宝，黄庆利，张彤，朱舜华，吴涵，
申请(专利权)人：徐州医科大学附属医院，
类型：发明
国别省市：