AS-RAPID制造技术

本发明专利技术涉及

【技术实现步骤摘要】
AS
‑
RAPID结核耐药双联检测引物探针组、试剂盒以及应用


[0001]本专利技术涉及
AS
‑
RAPID
结核耐药双联检测引物探针组
、
试剂盒以及应用，属于基因检测

。

技术介绍

[0002]耐药肺结核病是指肺结核患者的痰液中，如果能够分离出结核菌，而且通过试验发现这种结核菌在一种或多种抗结核药物存在时仍能生长，则患者将被确诊为耐药肺结核
。
也就是说，这名患者在治疗肺结核时，有一种或多种的抗结核药物已经不能起到杀灭结核菌的作用，需要更换不常用的二线药物进行治疗
。
[0003]利福平和异烟肼是治疗结核最主要的一线药物
。
利福平耐药性的遗传基础是：在正常情况下，利福平（
RFP
）与
RNA
聚合酶
B
亚基（
rpoB
）特异性结合，通过阻断
RNA
的合成而起到抑制细菌生长的作用，
rpoB
基因在利福平的药物选择压力下发生突变而改变所编码的
rpoB
亚基构象，从而降低与利福平的亲和力
。rpoB
基因突变一般发生在该基因内一个高度保守的
81bp
区域内（
RRDR
区：
507
‑
533
位
27
个氨基酸密码子）
。
异烟肼耐药性的分子基础比较复杂，己发现几个涉及异烟肼体内代谢过程中间性中间体形成有关的基因，其中与过氧化氢酶
‑
过氧化物酶编码基因
katG
和／或烯酰基还原酶编码基因
inbA
等基因突变有关
。
这两种酶都直接或间接的参与异烟肼中间体的形成
。
[0004]在现有技术中，有一些针对利福平和异烟肼耐药突变检测的相关技术，例如
CN102618625A
提供一种检测结核分枝杆菌耐药性的方法和试剂盒，该专利提供了鉴定待测样品中结核杆菌耐药性的专用引物和专用探针
。
其中，专用引物包括多个引物组，每个引物组针对一种耐药基因，并扩增包括突变位点在内的所有等位基因片段
。
而专用探针则与引物组中的共用引物和所有特异性引物的靶序列特异结合，该方法通过双重
Taqman
实时荧光
PCR
技术和序列特异性引物扩增技术检测待单个耐药类型检测多个耐药突变位点；但是，该方法涉及到
PCR
技术，反应流程需要需要调控温度参数
、
检测时间长
、
并且不能一次同时检测两种耐药基因
。CN102628085A
公开一种基于
PCR
扩增技术
+Hemin(DNA
过氧化物酶催化
)
显色反应的利福平耐药位点检测方法，但是该方法仍然需要采用常规
PCR
反应进行检测，并且也存在无法识别异烟肼耐药位点，导致了该方法的使用受限
。

技术实现思路

[0005]为解决以上所述现有技术中的问题，本专利技术的目的在于提供一种基于重组酶扩增等温检测（
RecombinaseAmPlificationIsothermalDetection, RAPID
）技术及等位基因特异性（
Allele
‑
Specific, AS
）检测技术用于结核分枝杆菌利福平耐药及异烟肼耐药碱基突变位点检测的
AS
‑
RAPID
检测试剂盒及方法
。
[0006]一种用于检测结核分枝杆菌耐药突变位点重组酶等温扩增的引物探针组，其中包含有用于扩增利福平耐药位点的引物组，其核苷酸序列为：
rpoB
‑
S450L
‑
F: TGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTTTT(SEQ ID NO.10)
rpoB
‑
H445Y
‑
F: ATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGAGCT(SEQ ID NO.22)rpoB
‑
L430P
‑
F: CGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCATCC(SEQ ID NO.33)rpoB
‑
S450L/H445Y/L430P
‑
R: ACACGATCTCGTCGCTAACCACGCCGTCG(SEQ ID NO.34)
包含有用于扩增异烟肼耐药位点的引物组，其核苷酸序列为：
katG
‑
S315T
‑
F: ACCAGCGGCCCAAGGTATCTCGCAACGGGAC(SEQ ID NO.45)katG
‑
S315T
‑
R: TGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACCTC(SEQ ID NO.40)
还包含：用于利福平耐药检测显色的探针，其核苷酸序列为：
5'6
‑
FAM
‑
AGCCGATCAGACCGATGTTGGGCCCCTCAG/idSp/GGTTTCGATCGGGCACATC
‑3’
Spacer C3(SEQ ID NO.7) ,idSP
位点用于作为核酸外切酶的识别
。
[0007]用于异烟肼耐药检测显色的探针，其核苷酸序列为：
5'6
‑
TAMRA
‑
AGCGCCAGCAGGGCTCTTCGTCAGCTCCCA/idSp/TCGTAGCCGTACAGGATC
‑3’
Spacer C3(SEQ ID NO.8) ,idSP
位点用于作为核酸外切酶的识别
。
[0008]上述的引物探针组在制备用于结核分枝杆菌利福平和异烟肼双耐药联检试剂盒中的应用，所述的应用中，在对样本进行重组酶等温扩增反应时，反应条件是
37
‑
45 ℃
，
10
‑
20 min。
[0009]所述的应用中，反应体系中用于检测利福平耐药的三条上游引物浓度为
400
‑
600 nM
，下游引物浓度为
200
‑
300nM
，探针浓度为
100
‑
200 nM
；反应体系中用于检测利福平耐药的上游引物浓度为
100
‑
200 nM
，下游引物浓度为
200
‑
400 nM
，探针浓度为
50
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于检测结核分枝杆菌耐药突变位点重组酶等温扩增的引物探针组，其特征在于，其中包含有用于扩增利福平耐药位点的引物组，其核苷酸序列为：
rpoB
‑
S450L
‑
F: TGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTTTT(SEQ ID NO.10)rpoB
‑
H445Y
‑
F: ATGGACCAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGAGCT(SEQ ID NO.22)rpoB
‑
L430P
‑
F: CGATCAAGGAGTTCTTCGGCACCAGCCATCC(SEQ ID NO.33)rpoB
‑
S450L/H445Y/L430P
‑
R: ACACGATCTCGTCGCTAACCACGCCGTCG(SEQ ID NO.34)
包含有用于扩增异烟肼耐药位点的引物组，其核苷酸序列为：
katG
‑
S315T
‑
F: ACCAGCGGCCCAAGGTATCTCGCAACGGGAC(SEQ ID NO.45)katG
‑
S315T
‑
R: TGGCACCGGAACCGGTAAGGACGCGATCACCTC(SEQ ID NO.40)。2.
根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，还包含：用于利福平耐药检测显色的探针，其核苷酸序列为：
AGCCGATCAGACCGATGTTGGGCCCCTCAG/idSp/GGTTTCGATCGGGCACATC (SEQ I...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵阳，张嫚嫚，梁相志，杨振，崔月利，
申请(专利权)人：南京迪飞医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：