一种制造技术

本发明专利技术涉及蛋白检测技术领域，具体公开了一种

【技术实现步骤摘要】
一种
α
‑
s1酪蛋白磷酸化程度检测方法、样品缓冲液及其应用


[0001]本专利技术涉及蛋白检测
，具体地说，涉及一种
α
‑
s1
酪蛋白磷酸化程度检测方法
、
样品缓冲液及其应用
。

技术介绍

[0002]酪蛋白是一种富含磷酸基团的蛋白质，它在乳制品中起着重要的作用
。
酪蛋白经过磷酸化修饰后能够影响其溶解性
、
电荷和结构等多个方面的性质，从而进一步影响其在乳制品生产和细胞生物学研究中的作用
。
其中，
α
s1
酪蛋白是一种特殊的酪蛋白，它是磷酸化最为常见的酪蛋白之一
。
α
s1
酪蛋白磷酸化是指在该蛋白的后翻译修饰过程中，通过激酶催化将磷酸基团添加到丝氨酸
、
苏氨酸等特定氨基酸上的化学反应
。
多个区域的
α
s1
酪蛋白含有类似的磷酸化位点，例如在
4、5、6、7
位置都有丝氨酸残基，这些位点的磷酸化已被证明会影响不同的
α
s1
酪蛋白性质
。
[0003]α
s1
酪蛋白的磷酸化可以影响其溶解性质
。
通过添加磷酸基团，酪蛋白的电荷分布发生改变，从而改善其与水分子的相互作用，提高其水溶性
。
同时，
α
s1
酪蛋白磷酸化也可以促进蛋白质聚集和凝固，类似于在乳酸菌发酵生产酸奶和乳酪等过程中发挥的作用
。
[0004]此外，
α
s1
酪蛋白的磷酸化还可以影响其在细胞生物学中的作用
。
通过磷酸基团介导的蛋白质相互作用，
α
s1
酪蛋白的磷酸化能够参与细胞信号传递
、
基因表达
、
细胞周期调控等许多生物学过程，从而影响了细胞内各个方面的功能和稳态
。
[0005]不同的
α
s1
酪蛋白磷酸化位点，通过引起酪蛋白结构的不同变化而具有不同的功能影响
。
例如，4位丝氨酸磷酸化可增大酪蛋白分子与亲水溶剂间的接触面积，从而增加其溶解度和稳定性；而磷酸化5和6位置的丝氨酸则具有抗氧化性质，这可能与磷酸化后的酪蛋白具有更好的电子供体
/
受体特性有关
。
[0006]一般来说，蛋白质的磷酸化和去磷酸化可以调节蛋白质功能的几乎所有方面，例如它的生物活性
、
稳定性和在
protein
‑
protein
（蛋白质
‑
蛋白质）相互作用中的起始作用
。
特别是在酪蛋白中，磷酸化是稳定酪粒体中钙磷酸盐纳米团簇和酪粒体内部结构的关键因素之一
。
这种独特的微粒结构使得奶可以向新生儿输送大量的钙和磷，而不会增加乳腺生物钙化的风险
。
酪蛋白的磷酸化状态在不同类型的酪蛋白中有很大的差异
。
尽管
α
S1
‑
CN、
α
S2
‑
CN、
β
‑
CN
和
κ
‑
CN
都是磷蛋白质，它们携带的磷酸化基团数（
n
×
P
）差异却很大，从
κ
‑
CN
上的
1P
至
3P
，到
β
‑
CN
上的
4P
至
5P
，到
α
S1
‑
CN
上的
8P
至
9P
，再到
α
S2
‑
CN
上的
10P
至
13P。
引起酪蛋白磷酸化状态差异的原因以及对酪粒体内部结构的影响尚不清楚，可能因酪蛋白类型而异
。
[0007]α
S1
‑
CN
的磷酸化差异特别引人关注，因为总
α
S1
‑
CN
在牛奶的总酪蛋白质量分数中占
40%
以上，并且它有2种常见的磷酸化状态：
α
S1
‑
CN
‑
8P
和
α
S1
‑
CN
‑
9P。
α
S1
‑
CN
‑
9P
第
56
位丝氨酸残基包括信号肽的位置上有一个额外的磷酸化残基，之前被称为
α
S0
‑
CN。
α
S1
‑
CN
‑
8P
质量分数比
α
S1
‑
CN
‑
9P
质量分数高3倍
。
[0008]磷酸化程度差异意味着，酪蛋白胶体团簇对于钙
、
镁等金属离子的耐受程度不同
从而对蛋白质的结构和功能产生影响，例如，磷酸基团数量的差异可能影响蛋白质的热稳定性和溶解性
。
在食品工业中，这两种不同磷酸基团数量的
α
s1
‑
CN
有不同的应用方向，例如，9磷酸基团的
α
s1
‑
CN
更适合作为乳制品中的乳粉的原料，而8磷酸基团的
α
s1
‑
CN
更适合作为乳酪中的乳蛋白原料
。
牦牛乳中两种
α
s1
‑
CN
含量相同比例接近于1，而在荷斯坦牛乳中8磷酸基团的
α
s1
‑
CN
含量比9磷酸基团
α
s1
‑
CN
高
2.79
倍
。
更高的
α
s1
‑
CN
‑9比例使得牦牛乳拥有更好的热稳定性
。
α
‑
s1
酪蛋白磷酸化程度的检测可应用于产品物理性能的评价等方面
。
[0009]现有技术中已有以红外吸收光谱法进行酪蛋白磷酸化程度检测的方案，但此方法前处理时间长，需要真空膜透析一昼夜，且冷冻干燥一昼夜且红外吸收光谱法存在吸收峰模糊，且定性能力差等问题
。
[0010]现有技术中还有以液相色谱
‑
质谱联用方法（
LC
‑
MS
）进行酪蛋白磷酸化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种
α
‑
s1
酪蛋白磷酸化程度检测方法，其特征在于，先对待测样品进行前处理，之后再采用毛细管区带电泳技术进行检测；所述前处理包括：（1）将所述待测样品升温至
50
‑
55 ℃
，
50
‑
55 ℃
保温条件下进行超声处理，超声功率为
100
‑
200 W
，超声处理时间为
20
‑
40 min
，获得预处理后的待测样品；（2）将所述预处理后的待测样品温度降至
3.8
‑
4.2 ℃
，与
3.8
‑
4.2 ℃
的样品缓冲液
A
混合，获得待测样品第一混合液；所述样品缓冲液
A
与预处理后的待测样品的体积比为1：（
2.8
‑
3.2
）；所述样品缓冲液
A
包括：
50
‑
200 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷，
0.1
‑
2 mol/L 一价盐和
/
或二价盐，5‑
10 mmol/L 二硫苏糖醇和1‑
10 mol/L EDTA
钠盐，
pH
为
7.8
‑
8.2
；（3）将所述待测样品第一混合液的温度调整至
22
‑
27 ℃
，与样品缓冲液
B
混合，所述样品缓冲液
B
与预处理后的待测样品的体积比为1：（
0.8
‑
1.2
）；所述样品缓冲液
B
包括：
50
‑
200 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷，
0.1
‑
1 mmol/L 辛酸钠和
0.1
‑
0.5
ꢀ‰
（
w/w
）分散剂，
pH
为
7.8
‑
8.2。2.
根据权利要求1所述的
α
‑
s1
酪蛋白磷酸化程度检测方法，其特征在于，所述一价盐为钠盐和
/
或钾盐；所述二价盐为钙盐和
/
或镁盐；所述
EDTA
钠盐为
EDTA
‑
2Na
和
/
或
EDTA
‑
4Na
；所述分散剂为羟丙基甲基纤维素
、
羟丙基乙基纤维素
、
聚丙烯酰胺中的一种或多种；和
/
或，所述样品缓冲液
A
和所述样品缓冲液
B
的
pH
值由盐酸调整获得
。3.
根据权利要求2所述的
α
‑
s1
酪蛋白磷酸化程度检测方法，其特征在于，步骤（1）中，将所述待测样品升温至
55 ℃
，
55 ℃
保温条件下进行超声处理，超声功率为
180 W
，超声处理时间为
30 min
；和
/
或，所述一价盐为氯化钠，所述二价盐为氯化钙；和
/
或，所述盐酸的浓度为
3.5
‑
4.5 mol/L。4.
根据权利要求1所述的
α
‑
s1
酪蛋白磷酸化程度检测方法，其特征在于，所述样品缓冲液
A
包括：
100 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷，
0.5 mol/L NaCl
，
5 mmol/L 二硫苏糖醇和
4 mol/L EDTA
‑
4Na
，
pH
为8；所述样品缓冲液
A
与预处理后的待测样品的体积比为1：3；所述样品缓冲液
B
包括：
100 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷，
0.5 mmol/L 辛酸钠和
0.1
‰
（
w/w
）羟丙基甲基纤维素，
pH
为8；所述样品缓冲液
B
与预处理后的待测样品的体积比为1：
1。5.
根据权利要求1‑4任一项所述的
α
‑
s1
酪蛋白磷酸化程度检测方法，其特征在于，所述待测样品为含有
α
‑
s1
酪蛋白的液体物质；若所述待测样品为含有脂肪的乳制品，则在所述待测样品进行超声处理前还包括低温离心的步骤，所述低温离心后取下层待测样品液体进行后续操作；所述低温离心的条件为：
3.8
‑
4.2 ℃
，离心转速
3000
‑
5000 rpm
，离心时间
20
‑
40 min。6.
根据权利要求1‑4任一项所述的
α
‑
s1
酪蛋白磷酸化程度检测方法，其特征在于，所述预处理后的待测样品与所述样品缓冲液
A
混合后，保温
60
‑
120 min
；所述待测样品第一混合液与所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：于声波，母智深，刘宇，王彩霞，高增丽，乌云，曹文慧，董阳，董雪娜，
申请(专利权)人：内蒙古蒙牛乳业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：