工程化制造技术

本发明专利技术属于酶工程技术领域，具体涉及工程化

【技术实现步骤摘要】
工程化
β
‑
氨基醇脱氢酶及其在手性(R)
‑
β
‑
氨基醇制备中的应用


[0001]本专利技术属于酶工程
，具体涉及工程化
β
‑
氨基醇脱氢酶及其在手性
(R)
‑
β
‑
氨基醇制备中的应用
。

技术介绍

[0002]手性
β
‑
氨基醇是一类重要的手性化学品，可以作为不对称有机合成的手性助剂或手性配体，同时也是许多药物合成的关键手性中间体
。
例如，
(S)
‑2‑
氨基
‑3‑
甲基
‑1‑
丁醇是合成
HIV
‑1整合酶抑制剂
‑
埃替拉韦
(Elvitegravir)
的关键中间体；
(S)
‑2‑
氨基丁醇是合成抗结核药物
‑
乙胺丁醇
(Ethambutol)
的关键中间体；
(R)
‑2‑
氨基
‑2‑
苯基乙醇是制备3‑
磷酸肌醇依赖性蛋白激酶
‑
1(PDK1)
抑制剂的基础化合物；
(R)
‑2‑
氨基
‑3‑
苯基丙醇是生产嗜睡新药
‑
索利氨酯
(Solriamfetol)
的核心手性砌块
。
因此，手性
β
‑
氨基醇具有广泛的应用领域和巨大的市场潜力，其合成方法的开发具有重要意义
。
[0003]生物催化法具有专一性强
、
反应条件温和
、
环境友好等特点，被视为手性
β
‑
氨基醇合成的理想工艺路线
。
在众多生物催化工艺中，基于胺脱氢酶的催化工艺受到了广泛关注，因为它具有严格的立体选择性和较高的原子经济性
。
胺脱氢酶是一类氧化还原酶，能够可逆地催化胺类化合物的氧化脱氨或酮类化合物的还原胺化
。
目前，大多数已报道的胺脱氢酶是通过对天然
L
‑
氨基酸脱氢酶进行分子改造而获得的，此类工程化胺脱氢酶对于
(S)
型氨基醇具有严格的立体选择性
。
在以往的研究中，已有研究人员利用工程化胺脱氢酶对
α
‑
羟基酮的还原胺化活性成功实现了多种手性
(S)
‑
β
‑
氨基醇的不对称合成
。
同理，通过利用胺脱氢酶的氧化脱氨活力催化外消旋
β
‑
氨基醇发生动力学拆分来制备手性
(R)
‑
β
‑
氨基醇同样具有较大的应用潜力
。
但是，现有的工程化胺脱氢酶主要是针对还原胺化活力进行开发的，其催化
β
‑
氨基醇氧化脱氨的活力较低，且底物谱较窄
。
因此，手性
(R)
‑
β
‑
氨基醇的生物催化合成仍然面临巨大的挑战，亟需开发更加有效实用的生物催化合成法
。

技术实现思路

[0004]为了克服上述现有技术的不足，本专利技术通过对热泉宏基因组来源的缬氨酸脱氢酶的活性中心进行了两轮分区分子改造，获得了一类能够高效催化
(S)
‑
β
‑
氨基醇氧化脱氨的工程化
β
‑
氨基醇脱氢酶
。
这些工程化
β
‑
氨基醇脱氢酶能够以外消旋
β
‑
氨基醇为原料进行动力学拆分制备手性纯
(R)
‑
β
‑
氨基醇，具有较高的实际应用价值
。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
[0006]本专利技术第一方面提供了一种工程化
β
‑
氨基醇脱氢酶，所述工程化
β
‑
氨基醇脱氢酶的氨基酸序列如
SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10
任一所示
。
[0007]本专利技术对一个来源于热泉宏基因组的缬氨酸脱氢酶的同源结构模型进行了结构解析，发现其活性中心可分为羧基结合区域
、
催化位点区域与侧链结合区域
。
接着，对其活
性中心的羧基结合位点进行了组合突变，筛选获得了一个对
(S)
‑
β
‑
氨基醇具有氧化脱氨活力的突变体
N261M。
在此基础上，针对活性中心侧链结合区域的5个氨基酸残基构建了精简组合突变库，并通过对不同类型底物进行筛选，成功获得底物谱显著拓宽的缬氨酸脱氢酶突变体，即为工程化
β
‑
氨基醇脱氢酶
。
因此，所述工程化
β
‑
氨基醇脱氢酶为对
SEQ ID NO.1
所示的缬氨酸脱氢酶氨基酸序列的第
113
位丙氨酸
、
第
114
位谷氨酸
、
第
146
位脯氨酸
、
第
261
位天冬酰胺
、
第
291
位缬氨酸和第
294
位异亮氨酸残基进行单点或组合突变而形成的突变体
。
具体包括将
SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列的第
261
位天冬酰胺突变为甲硫氨酸而形成的突变体
(SEQ ID NO.2)
，将
SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列的第
114
位谷氨酸，第
261
位天冬酰胺分别突变为甘氨酸和甲硫氨酸而形成的突变体
(SEQ ID NO.3)
，将
SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列的第
113
位丙氨酸
、
第
114
位谷氨酸和第
261
位天冬酰胺分别突变为甘氨酸
、
丙氨酸和甲硫氨酸而形成的突变体
(SEQ ID NO.4)
，将
SEQ ID NO.1
所示氨基酸序列的第
113
位丙氨酸
、
第
114
位谷氨酸
、
第
146
位脯氨酸和第...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种工程化
β
‑
氨基醇脱氢酶，其特征在于，所述工程化
β
‑
氨基醇脱氢酶的氨基酸序列如
SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10
任一所示
。2.
编码权利要求1所述的工程化
β
‑
氨基醇脱氢酶的基因，其特征在于，所述基因的序列如
SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19
任一所示
。3.
包含权利要求1所述的工程化
β
‑
氨基醇脱氢酶的表达载体
。4.
包含权利要求1所述的工程化
β
‑
氨基醇脱氢酶的重组工程菌
。5.
权利要求1所述的工程化
β
‑
氨基醇脱氢酶在制备
(R)
‑
β
‑
氨基醇中的应用
。6.
一种制备
(R)
‑
β
‑
氨基醇的方法，其特征在于，将权利要求1所述的工程化
β
‑
氨基醇脱氢酶加入含有外消旋
β
‑
氨基醇底物
、NAD
+
及
NAD
+
再生系统的混合体系中进行拆分反应，制得
(R)
‑
β
‑
氨基醇
。7.
根据权利要求6所述的一种制备
(R)
‑
β
‑
氨基醇的方法，其特征在于，所述
NAD
+
再生系统为以
NADH

【专利技术属性】
技术研发人员：尹新坚，龚文忠，陈碧双，刘岚，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：