一种半夏超低温保存再生植株和脱毒的方法技术

本发明专利技术公开了一种半夏超低温保存再生植株和脱毒的方法，包括材料培养

【技术实现步骤摘要】
一种半夏超低温保存再生植株和脱毒的方法


[0001]本专利技术属于作物繁育
，具体涉及一种半夏超低温保存再生植株和脱毒的方法
。

技术介绍

[0002]半夏
Pinelliaternate(Thunb.)Beri.
为天南星科植物，半夏属多年生草本植物，以块茎入药，具有燥湿化痰
、
降逆止呕
、
消痞散结之功效，是我国常用大宗中药材，已有
2000
多年的药用历史
。
近年我国半夏市场需求量在
6000
吨左右，我国近
800
多家中药企业，近
558
个处方中都使用半夏，半夏使用频率居第
22
位
。
近年来研究发现，半夏具有抗肿瘤
、
抗炎
、
抗菌
、
抗癫痫等多种重要作用
。
而随着半夏药用价值的不断开发，其需求量日益增多，半夏野生资源日益减少
。
种质资源是作物育种稳定发展的基础保障，无性繁殖作物种质资源主要采用田间保存和离体保存
。
田间保存需要占用大量的土地和人力资源，成本高，且易遭受各种自然灾害的侵袭
。
离体保存可以有效节省土地及劳动力，保存方法比较简单，并且能够在保存过程中不受病毒等微生物的危害
。
超低温保存是将离体的植物材料置于液氮中（
‑
196℃
）进行保存，理论上材料可以无限期保存，并且最大程度地保持其遗传稳定性
。
目前半夏药材主要来源于大田栽培，半夏主要依靠珠芽进行无性繁殖，导致栽培种质退化及资源混杂问题非常严重，加之人们无节制的采挖野生资源，造成野生种质几乎绝迹，再加之长期的无性繁殖使得病毒在植株中大量积累，抑制植株的正常生长，种质逐年衰退，从而严重影响了半夏产量及品质的提高
。
超低温保存技术不仅可用于保存植物种质资源还可以用于植物脱毒，其脱毒机理已通过病毒在植物茎尖的定位
、
组织学和细胞超微结构观察得到揭示
。
茎尖顶端分生组织细胞排列紧密，具有较大的核质比，液泡体积也较小，因此超低温处理后细胞内不易结冰，更易成活
。
根据病毒在植物上的不均匀分布假说，通常顶端分生组织区域不带或带有少量的病原菌，经超低温冷冻后，成活的细胞可能是无毒的
。
而其他部位的细胞随着与项端分生组织的距离的增加，细胞和液泡体积变大，核质比变小，而通常大液泡，低核质比的细胞经超低温冷冻后的成活率较低
。
由于顶端分生组织细胞具有较强的分裂能力，可以形成植物器官，而带毒的细胞被杀死
。
因此，由不带病毒的细胞发育成完整的植株也是无毒的
。
有关半夏的超低温保存和脱毒研究未见报道
。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种半夏超低温保存再生植株和脱毒的方法，以期通过半夏玻璃化超低温保存实现半夏种质资源安全保存及为半夏脱毒提供技术方法
。
[0004]为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为：步骤一
、
材料培养：将健康半夏种茎或感病半夏种茎播种于花盆中萌发生长获得半夏植株，取其叶柄消毒后切至
0.5
‑
2cm
，的小段接种至
1/2MS
培养基中培养获得一个独立完整的小块茎并萌发成苗，以试管苗的叶柄为材料再次诱导培养获得小块茎并萌发成苗，得到一代块茎和一代
苗，剪去其茎叶，将一代块茎转接至新鲜培养基中，块茎再次萌发成苗并长大，得到二代块茎和二代苗，选取二代块茎中的二代健康试管块茎或二代病株试管块茎，待其茎叶枯萎处于休眠状态时，将块茎连同培养瓶于
4℃
低温黑暗预处理1‑2周；步骤二
、
装载处理：从步骤一得到的二代健康试管块茎或二代感病试管块茎上剥离出
0.2
‑
1mm
大小的茎尖，将茎尖置于装有
1mL
过滤灭菌的装载液的无菌冻存管中，装载液的配方为
MS+2mol/L
甘油
+0.4mol/L
蔗糖
+
谷胱甘肽1μ
mol/L
，
pH5.7
，室温下处理
20min
后用移液枪吸去装载液；步骤三
、
玻璃化处理：向步骤二得到的无菌冻存管中加入
1.0
‑
2mL
过滤灭菌的
PVS2
玻璃化保护液，
PVS2
玻璃化保护液的配方为
MS+30%
甘油
+15%
乙二醇
+15%
二甲基亚砜
+0.4M
蔗糖
+
谷胱甘肽1μ
mol/L
，
pH5.7
，在室温下处理茎尖
20
‑
120min
；步骤四
、
超低温处理：将步骤三得到的无菌冻存管投入液氮保存，保存时间不少于
120min
；步骤五
、
化冻和回温处理：将步骤四得到的无菌冻存管从液氮中取出，于
38℃
水浴化冻
2min
；步骤六
、
卸载处理：待化冻结束后，用移液枪吸去无菌冻存管中的
PVS2
玻璃化保护液，然后加入
1.0
‑
2mL
过滤灭菌的卸载液，卸载液的配方为
1/2MS+1.2mol/L
蔗糖，
pH5.7
，处理茎尖
20min
；步骤七
、
再生植株培养：将步骤六处理后的茎尖从无菌冻存管中取出，用无菌滤纸吸干表面的卸载液，接种到
1/2MS+6
‑
KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L+
谷胱甘肽1μ
mol/L+
赤霉素
0.1mg/L+
酸水解酪蛋白
200mg/L+0.7%
琼脂，
pH5.8
的培养基中进行培养，先暗培养
7d
，再转入
500
‑
1000LUX
弱光条件下培养再生植株
。
[0005]本专利技术相较于现有技术的有益效果为：本专利技术建立的半夏玻璃化超低温保存技术体系可应用于半夏种质资源保存，相较于田间保存和延缓生长保存技术，该技术可大大节省人力物力，操作简便，不易遭受自然灾害侵袭，无需定期转接植物材料，具有占用空间小
、
保存成本低
、
保存时间长
、
遗传稳定等众多优点，可长期保存半夏种质
。
[0006]众多学者一致认为，无本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种半夏超低温保存再生植株和脱毒的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤一
、
材料培养：将健康半夏种茎或感病半夏种茎播种于花盆中萌发生长获得半夏植株，取其叶柄消毒后切至
0.5
‑
2cm
，的小段接种至
1/2MS
培养基中培养获得一个独立完整的小块茎并萌发成苗，以试管苗的叶柄为材料再次诱导培养获得小块茎并萌发成苗，得到一代块茎和一代苗，剪去其茎叶，将一代块茎转接至新鲜培养基中，块茎再次萌发成苗并长大，得到二代块茎和二代苗，选取二代块茎中的二代健康试管块茎或二代病株试管块茎，待其茎叶枯萎处于休眠状态时，将块茎连同培养瓶于
4℃
低温黑暗预处理1‑2周；步骤二
、
装载处理：从步骤一得到的二代健康试管块茎或二代感病试管块茎上剥离出
0.2
‑
1mm
大小的茎尖，将茎尖置于装有
1mL
过滤灭菌的装载液的无菌冻存管中，装载液的配方为
MS+2mol/L
甘油
+0.4mol/L
蔗糖
+
谷胱甘肽1μ
mol/L
，
pH5.7
，室温下处理
20min
后用移液枪吸去装载液；步骤三
、
玻璃化处理：向步骤二得到的无菌冻存管中加入
1.0
‑
2mL
过滤灭菌的
PVS2
玻璃化保护液，
PVS2
玻璃化保护液的配方为
MS+30%
甘油
+15%
乙二醇
+15...

【专利技术属性】
技术研发人员：何春雨，张延红，郭清毅，董婉琦，高素芳，
申请(专利权)人：甘肃中医药大学，
类型：发明
国别省市：