一种促进番茄果实成熟的基因及其方法技术

一种促进番茄果实成熟的基因及其方法，所述基因的核苷酸序列如

【技术实现步骤摘要】
一种促进番茄果实成熟的基因及其方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及到一种调控番茄果实成熟的基因及其方法，特别涉及一种
AP2/ERF
家族转录因子
SlERF.D3
，该基因在调控番茄果实成熟中的应用
。

技术介绍

[0002]番茄（
Solanum lycopersicum
），又名西红柿，是世界第二大蔬菜作物，也是我国广泛种植的经济作物之一，不仅酸甜可口，而且营养价值丰富
。
番茄富含维生素
A、
维生素
C、
番茄红素以及多酚类物质，可以防衰老
、
防癌
、
抗辐射，因此成为人们生活中不可或缺的食品之一，是淡季生长销售中经济效益较高的蔬菜之一
。
但番茄果皮较薄
、
水分含量大，在运输及贮藏过程中容易遭受机械损伤以及微生物的侵染，导致番茄的货架周期变短，因此研究番茄的生长及成熟衰老的调控机制对于延长货架期仍是当今的研究重点
。
番茄为自花授粉植物，兼具生长周期短以及基因组测序完成等特点，所以番茄常作为研究果实生长
、
成熟衰老的模式作物
。
[0003]早熟番茄由于生长周期短，可以提早上市，有效缓解由于果蔬菜季节性生产而带来的需求问题，延长供应期，具有较好的销售前景和经济效益
。
同时由于生长周期变短，可相应减少病虫害对果实的侵袭，提高产品的质量
。
>因此找寻一种可以促进番茄早熟的转录因子对于未来提高番茄的经济效益和产品质量具有重要的意义
。
[0004]AP2/ERF
转录因子作为植物体内最大的转录因子家族之一，曾被人们认为是植物界特有的一类转录因子，具有重要的调节功能
。AP2/ERF
转录因子可以通过响应乙烯信号参与果实的发育过程
、
调控果实的颜色及风味变化等调控果实成熟；可以通过某些激素信号通路参与病虫害信号的传导，促进相应抗性基因的表达
。
鉴于该类转录因子的重要调控功能，在番茄中寻找新的
ERF
转录因子仍然是园艺领域的重要任务
。
[0005]在水稻中过表达
AP2/ERF
家族转录因子
OsRPH1
导致水稻株高
、
节间和叶鞘长度降低，表明该转录因子负调控植株的生长
。
玉米
AP2
基因
sid1
和
ids1
可以对花序分生组织和小穗分生组织进行调控（
Chunk G,Meeley R,Hake S.2008,Development,135(18):3013
‑
3019
）
。
在植物体中，作为生物反应原料以及提供反应环境的水分，在平衡条件之下参与多种生理调节过程，如光合作用
、
蒸腾以及呼吸作用等，因此水分平衡对植物生长起着至关重要的作用，若发生水分胁迫，将严格限制植物的生长
。
有研究表明，
AP2/ERF
转录因子在抵抗水分胁迫中发挥重要调节作用，如
ZmERE180
可以增强不定根的形成和提高抗氧化剂的水平延长玉米在水分胁迫下的生长期（
Yu F,Liang K,Fang T,et al.2019,Plant Biotechnol J,17(12):2286
‑
2298
）
。
但是在番茄中对于
AP2/ERF
家族转录因子可以调控果实成熟衰老的研究还鲜有报道
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种促进番茄果实成熟的基因及其方法
。
[0007]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种促进番茄果实
成熟的基因，所述进番茄果实成熟的基因的核苷酸序列如
SEQ ID No.1
所示
。
[0008]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种促进番茄果实成熟的方法，包括下列步骤：步骤1：
gRNA
靶点接头引物的制备；步骤2：
gRNA
表达盒构建：配制包含步骤1中靶点接头引物的酶切连接反应液，采用边切边连法使靶点接头与
gRNA
表达盒连接，扩展
gRNA
表达盒；步骤3：以步骤2的产物为模板，进行第一轮
PCR
扩增；再以第一轮
PCR
产物为模板进行第二轮
PCR
扩增，利用琼脂糖凝胶电泳检测产物浓度，随后对第二轮
PCR
产物使用
DNA
纯化试剂盒进行纯化回收；步骤4：采用边切边连的方法对步骤3的纯化产物与
CRISPR
‑
CAS9
质粒进行连接，获得连接好的质粒；步骤5：将步骤4连接好的质粒转化大肠杆菌
DH5
α
感受态细胞；步骤6：挑取步骤5获得的阳性单克隆菌落进行
PCR
鉴定，对所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得
SlERF.D3
‑
CRISPR
‑
CAS9
质粒；步骤7：将
SlERF.D3
‑
CRISPR
‑
CAS9
质粒转化
EHA105
农杆菌感受态细胞，获得构建好的
SlERF.D3
‑
CRISPR
‑
CAS9
载体的农杆菌单菌落；步骤8：将构建好的
SlERF.D3
‑
CRISPR
‑
CAS9
载体的农杆菌单菌落对番茄进行遗传转化
。
[0009]优选的技术方案为：
gRNA
靶点引物接头的制备是先将靶点接头引物溶解成
100
µ
M
的母液，再分别将靶点一正向引物
‑
F1
和
R1
引物和靶点一反向引物
‑
R1
混合稀释到1ꢀµ
M
得到第一混合引物，靶点二正向引物
‑
F2
和靶点二反向引物
‑
R2
混合稀释到1ꢀµ
M
得到第二混合引物；
80
‑
100℃ 30S
，随后转移至室温冷却完成退火；靶点接头引物的核苷酸序列如下：靶点一正向引物
‑
F1
：5’‑
gtcaCAGCAGCAACCAAGGCTTAC
‑3’
；靶点一反向引物
‑
R1
：5’‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种促进番茄果实成熟的基因，其特征在于：所述进番茄果实成熟的基因的核苷酸序列如
SEQ ID No.1
所示
。2.
一种促进番茄果实成熟的方法，其特征在于：包括下列步骤：步骤1：
gRNA
靶点接头引物的制备；步骤2：
gRNA
表达盒构建：配制包含步骤1中靶点接头引物的酶切连接反应液，采用边切边连法使靶点接头与
gRNA
表达盒连接，扩展
gRNA
表达盒；步骤3：以步骤2的产物为模板，进行第一轮
PCR
扩增；再以第一轮
PCR
产物为模板进行第二轮
PCR
扩增，利用琼脂糖凝胶电泳检测产物浓度，随后对第二轮
PCR
产物使用
DNA
纯化试剂盒进行纯化回收；步骤4：采用边切边连的方法对步骤3的纯化产物与
CRISPR
‑
CAS9
质粒进行连接，获得连接好的质粒；步骤5：将步骤4连接好的质粒转化大肠杆菌
DH5
α
感受态细胞；步骤6：挑取步骤5获得的阳性单克隆菌落进行
PCR
鉴定，对所得的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得
SlERF.D3
ꢀ‑
CRISPR
‑
CAS9
质粒；步骤7：将
SlERF.D3
ꢀ‑
CRISPR
‑
CAS9
质粒转化
EHA105
农杆菌感受态细胞，获得构建好的
SlERF.D3
‑
CRISPR
‑
CAS9
载体的农杆菌单菌落；步骤8：将构建好的
SlERF.D3
‑
CRISPR
‑
CAS9
载体的农杆菌单菌落对番茄进行遗传转化
。3.
根据权利要求2所述的促进番茄果实成熟的方法，其特征在于：
gRNA
靶点引物接头的制备是先将靶点接头引物溶解成
100
µ
M
的母液，再分别将靶点一正向引物
‑
F1
和
R1
引物和靶点一反向引物
‑
R1
混合稀释到1ꢀµ
M
得到第一混合引物，靶点二正向引物
‑
F2
和靶点二反向引物
‑
R2
混合稀释到1ꢀµ
M
得到第二混合引物；
80
‑
100℃ 30S
，随后转移至室温冷却完成退火；靶点接头引物的核苷酸序列如下：靶点一正向引物
‑
F1
：5’‑
gtcaCAGCAGCAACCAAGGCTTAC
‑3’
；靶点一反向引物
‑
R1
：5’‑
aaacGTAAGCCTTGGTTGCTGCTG
‑3’
；靶点二正向引物
‑
F2
：5’‑
gtcaTTCTTCAGCGCCTGCTGCTG
‑3’
；靶点二反向引物
‑
R2
：5’‑
aaacCAGCAGCAGGCGCTGAAGAA
‑3’
。4.
根据权利要求2所述的促进番茄果实成熟的方法，其特征在于：步骤2中，为确保
Bsal
酶的活性，先对
BsaI
的酶活进行检测，反应体系为
10
µ
L
，其中含有
Bsal
酶
0.5
µ
L、100ngRNA
‑
U#
载体，
10
×
Cutsmart buffer 1
µ
L
，
ddH2O
补充至
10
µ
L
，
PCR
程序设置为
37℃
，
15min
，随后进行琼脂糖凝胶电泳检查是否切出目标条带；如果切出目标条带，则说明
Bsal
酶活性好，可以使用；靶点接头与
gRNA
表达盒采用边切边连的方法，包括：
gRNA
‑
U#
质粒1ꢀµ
L
，第一混合引物
0.5
ꢀµ
L
，
BsaI 酶
0.4
ꢀµ
L
，
10
×
Cutsmart buffer 1
µ
L
，
T4 DNA ligase 0.1
ꢀµ
L
，
10
×
T4 DNA ligase buffer 0.5
ꢀµ
L
，
ddH2O
补充至
10
µ
L
，
PCR
程序设置为
37℃ 5min
，
20℃ 5min
，5个循环，获得第一连接产物；
gRNA
‑
U#
质粒1ꢀµ
L
，第二混合引物
0.5
ꢀµ
L
，
BsaI 0.4
ꢀµ
L, 10
×
Cutsmart buffer 1
µ
L
，
T4 DNA ligase 0.1
ꢀµ
L
，
10
×
T4 DNA ligase buffer 0.5
ꢀµ
L
，
ddH2O
补充至
10
µ
L
，
PCR
程序设置为
37℃ 5min
，
20℃ 5min
，5个循环，获得第二连接产物
。5.
根据权利要求2所述的促进番茄果实成熟的方法，其特征在于：步骤3中，
每个
gRNA
表达盒含2轮
PCR
反应，在第一轮轮
PCR
中，共含4个反应，反应总体系为
50 μ
L
；靶点一的反应一为：取
1 μ
L
第一连接产物为模板，2ꢀµ
L U
‑
F
，2ꢀµ
L 靶点一反向引物
‑
R1
，1ꢀµ
L Super
‑
Fidelity DNA Polymerase
，
10
ꢀµ
L 5
×
Super
‑
Fidelity DNA Polymerase buffer
，1ꢀµ
L dNTPs
，
ddH2O
补充至
50
µ
L
，获得第三连接产物；靶点一的反应二为：取
1 μ
L
第一连接产物为模板，2ꢀµ
L gRNA
‑
R
，2ꢀµ
L
靶点一正向引物
‑
F1
，1ꢀµ
L Super
‑
Fidelity DNA Polymerase
，
10
ꢀµ
L 5
×
Super
‑
Fidelity DNA Polymerase buffer
，1ꢀµ
L dNTPs
，
ddH2O
补充至
50
µ
L
，获得第四连接产物；靶点二的反应一为：取
1 μ
L
第二连接产物为模板，2ꢀµ
L U
‑
F
，2ꢀµ
L 靶点二反向引物
‑
R1
，1ꢀµ
L Super
‑
Fidelity DNA Polymerase
，
10
ꢀµ
L 5
×
Super
‑
Fidelity DNA Polymerase buffer
，1ꢀµ
L dNTPs
，
ddH2O
补充至
50
µ
L
，获得第五连接产物；靶点二的反应二为：取
1 μ
L
第二连接产物为模板，2ꢀµ
L gRNA
‑
R
，2ꢀµ
L
靶点二正向引物
‑
F1
，1ꢀµ
L Super
‑
Fidelity DNA Polymerase
，
10
ꢀµ
L 5
×
Super
‑
Fidelity DNA Polymerase buffer
，1ꢀµ
L dNTPs
，
ddH2O
补充至
50
µ
L
，获得第六连接产物；
PCR
程序设置为：
95℃
预变性
1min
，
95℃
变性
10s
，
60℃
退火
15s
，
72℃
延伸
15s
，
25
个循环；最后
72℃
延伸
10min
；扩增结束后取
5 μ
l
产物用
2%
琼脂糖胶电泳进行检测；
U
‑
F
：5’‑
CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG
‑3’
；
gRNA
‑
R
：5’‑
CGGAGGAAAATTCCATCCAC
‑3’
；进行第二轮
PCR
反应之前，预先将位置特异引物对混合成
10
×
工作液，每种
1.5
ꢀµ
M
：引物组合工作液
PT1=1.5
ꢀµ
L B1
...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡康棣，张华，曾德新，刘站民，宗凯，姚改芳，马琳，耿美慧，张可欣，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：