萝卜制造技术

本发明专利技术公开了一种萝卜

【技术实现步骤摘要】
萝卜RsCDF3转录因子基因在提高植物耐冷性中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及萝卜
RsCDF3
转录因子基因在提高植物耐冷性中的应用
。

技术介绍

[0002]面对全球气候变化及随之而来的温度变化，植物不可避免地暴露在低温胁迫下，主要包括冷胁迫和冰冻胁迫
。
研究表明，低温胁迫易导致植物体细胞膜通透性增加
、
蛋白质空间构象改变
、
细胞代谢紊乱，活性氧
(ROS)
累积等，进而影响植物体正常生长发育过程，降低园艺作物产量和品质
。
[0003]萝卜
(Raphanus sativus L.)
为十字花科萝卜属一
、
二年生根菜类蔬菜作物，我国品种资源极其丰富，在蔬菜周年生产供应中发挥重要作用
。
冬季或早春季节，冷胁迫已成为限制萝卜肉质根形成膨大的主要因素，极大降低了萝卜产量品质与商品价值
。
系统解析萝卜冷胁迫响应的转录调控机制，选育优质耐冷萝卜优异种质及新品种是冬春萝卜高品质生产的根本保障
。
[0004]转录因子作为植物生长发育过程的重要调控因子，可通过协调多种信号通路来调控热响应通路
。CDF
转录因子隶属于
DOF
家族
D
亚类，可通过激活
/
抑制靶基因转录或与其它蛋白发生相互作用，广泛参与植物生长发育
、
信号转导与非生物胁迫等生物过程
。
过表达番茄
SlCDF1
和
SlCDF3
基因可增强植株耐干旱性与耐盐性；过表达
AtCDF3
基因增强拟南芥植株低温耐受性，并可提升渗透胁迫条件下植株的植物光合能力
。
相关研究结果为系统分析
RsCDF3
基因在冷胁迫响应调控网络中的生物学功能及优质耐冷萝卜新种质培育提供良好的理论依据
。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种涉及萝卜
RsCDF3
转录因子基因在提高植物耐冷性中的应用
。
[0006]为实现上述目的，本专利技术所述萝卜
RsCDF3
基因的
cDNA
序列如
SEQ ID NO.1
所示，主要技术方案如下：
[0007](1)
扩增萝卜
RsCDF3
基因
cDNA
序列；
[0008](2)RT
‑
qPCR
分析表明
RsCDF3
基因受
4℃
低温诱导显著上调表达，特别是在
12h
和
24h。
[0009](3)
利用同源重组反应，分别将
RsCDF3
基因
CDS
序列重组至
pCAMBIA1301
及
pTCK303
质粒，构建目的基因过表达及抑制表达重组质粒
。
[0010](4)
将
RsCDF3
基因过表达重组质粒转化至农杆菌，利用农杆菌侵染异源转化拟南芥适宜时期花序，利用
PCR、GUS
染色等方法，鉴定转基因阳性植株，以野生型
(WT)
植株为对照，分析过表达拟南芥植株耐冷性变化
。
[0011](5)
分别将
RsCDF3
基因过表达及抑制表达重组质粒转化至农杆菌，利用农杆菌瞬
时注射两周苗龄的萝卜子叶，分析冷胁迫处理下过表达与
RNAi
抑制表达萝卜子叶中
H2O2、O2·
‑
、MDA
和脯氨酸含量变化，解析
RsCDF3
基因对萝卜植株
ROS
累积与细胞膜通透性的影响
。
[0012]优选的是，以
cDNA
为模板进行
PCR
扩增时的上游引物为
SEQ ID NO.2
：
ATGATGATGGAAAGTAGAGATCCAGC
；下游引物为
SEQ ID NO.3
：
CTAGAC CCGTTCTTGGAAATTGA。
[0013]优选的是，以
cDNA
为模板进行
PCR
扩增时反应体系为：
[0014][0015]反应条件为：
[0016][0017]优选的是，荧光定量
PCR
反应的上游引物为
SEQ ID NO.4
：
CCCTTTCCCGGCTGTTTTTG
；下游引物为
SEQ ID NO.5
：
CCCCTGTCTCGGGTTTTGAA。
[0018]作为一种具体的实施方式，所述
RsCDF3
基因序列包括以下任一种类：
[0019](i)RsCDF3
基因
cDNA/DNA
序列及其编码氨基酸序列；
[0020](ii)
过表达
RsCDF3
基因序列后的基因重组构建体；
[0021](iii)
抑制或者敲除
RsCDF3
基因序列后的基因重组构建体
。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0023]本专利技术研究发现
RsCDF3
基因表达量受低温胁迫处理显著上调；异源转化分析表明过表达
RsCDF3
基因拟南芥植株低温耐受能力显著提高，存活率明显高于野生型株系；利用农杆菌注射法，瞬时转化萝卜子叶实验发现，
RsCDF3
基因可通过清除活性氧累积与增强细胞膜通透性，提高萝卜植株的耐冷性
。
本专利技术在作物分子改良中具有较高应用价值，对利用基因工程技术培育耐低温的萝卜具有重要的理论和实践意义
。
附图说明
[0024]图1为
RsCDF3
基因
cDNA
序列扩增
。
其中，泳道1为
DL2000
分子量标记，泳道2～3是
RsCDF3
基因
cDNA
片段
。
[0025]图2不同时间
4℃
低温胁迫下萝卜肉质根中
RsCDF3
基因表达模式
。
[0026]图
3 RsCDF3
转基因植株
PCR
分析电泳图
。
其中，泳道1为
DL2000
分子量标记，泳道2是野生型拟南芥植株
(WT)
，泳道3～9是过表达
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种萝卜
RsCDF3
转录因子基因在提高植物耐冷性中的应用，其特征在于，核苷酸序列如
SEQ ID NO
：1所示
。2.
一种用于扩增权利要求1所述
RsCF3
基因的引物对，其特征在于，所述引物对的碱基序列，如
SEQ ID NO
：
2、SEQ ID NO
：3所示
。3.
一种用于权利要求1所述编码
RsCDF3
基因的荧光定量
PCR
分析的引物对，其特征在于，所述引物对的碱基序列，如
SEQ ID NO
：4‑
SEQ ID NO
：5所示
。4.
一种用于构建过表达
、
抑制权利要求1所述
RsCDF3
基因表达的重组质粒引物对，其特征在于，所述引物对的碱基序列，如
SEQ ID NO
：8‑
SEQ ID NO
：
13
所示
。5.
一种根据权利要求1所述
RsCDF3
基因功能验证的方法，其特征在于，将构建好的过表达载体利用浸花法转入拟南芥中，得到相应的拟南芥转基因株系，所述阳...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐良，何敏，张维兰，张晓莉，柳李旺，王燕，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：