制备合成模板的方法技术

本文提供了一种制备方法，包括将试剂输送至微流控路径装置中的反应器，其中所述试剂包括感兴趣的合成基因

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】制备合成模板的方法
[0001]优先权要求
[0002]本专利申请要求题为“METHODS FOR MANUFACTURING ASYNTHETIC TEMPLATE”并于
2021
年2月8日提交的美国临时专利申请第
63/147,173
号的优先权，该专利申请通过引用以其整体并入本文
。
[0003]通过引用并入
[0004]本说明书中提及的所有出版物和专利申请通过引用以其整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被特定地和单独地指示为通过引用并入
。
[0005]背景
[0006]目前用于制备和配制多核苷酸治疗剂特别是
mRNA
治疗剂的可用技术经常使产物暴露于污染和降解
。
目前可用的集中生产对于用于可能包括多种多核苷酸物类的治疗制剂来说可能成本太高
、
太慢
、
而且易受污染
。
开发可扩展的多核苷酸制备
、
单个患者剂量生产
、
消除接触点以限制污染
、
输入和过程跟踪以满足临床制备要求
、
以及在护理点
(point
‑
of
‑
care)
操作中的应用，可以促进这些有前途的治疗方式的使用
。
微流控仪器和过程可以针对这些目标提供主要优势
。
[0007]本公开内容的概述
[0008]本文描述了用于制备可解决上述需求的各种治疗剂的方法和设备
(
例如，系统
)。
[0009]本文描述了可用于制备各种各样的疫苗和治疗剂的设备和方法
。
例如，本文描述了用于制备个性化治疗剂
(
包括疫苗
)
的方法和设备
(
例如，系统
、
装置等
)。
在一个非限制性实例中，本文描述的方法和设备可用于产生针对在皮肤
T
细胞淋巴瘤中有活性的癌症特异性抗原的治疗性
mRNA
疫苗
。
[0010]本公开内容涉及用于快速
、
高产率制备基于多核苷酸的治疗剂的方法和系统，并且可以具体地涉及治疗性
mRNA (
包括疫苗
)
的自动化制备，其可以快速和高效地进行
。
这样的治疗剂可以考虑患者特定的信息，并且可以按需产生，并且完全或部分地在护理点
(
例如，医院
、
诊所等
)
产生
。
因此，本文描述了用于
mRNA
治疗剂的自动化
、
高产率制备方法，任选地所述方法在护理点开展
。
[0011]本文所述的方法和设备可以包括在不使用细菌的情况下合成地形成用于
mRNA
形成的模板
。
在一些实例中，这些方法和设备可以在不使用任何细菌组分的情况下使用
。
这些方法和设备可以使用聚合酶作为聚合酶链式反应
(PCR)
的一部分来合成
mRNA
治疗剂，包括具有大于约
100bp(
例如大于约
150bp、
大于约
200bp
或更高
)
的单个多核苷酸重复
(
例如多
A)
尾的
mRNA
治疗剂
。
[0012]例如，本文描述了使用包含多于一个流体贮库的系统形成
(
例如，制造
、
制备
、
合成等
)
治疗性多核苷酸的方法，所述流体贮库被配置为与一个或更多个微流控路径装置以密封流体连通固定，该方法包括：在受保护而免于大气接触的密封且封闭的流控路径中，在多于一个流体贮库中的一个或更多个流体贮库与一个或更多个微流控路径装置上的多于一个反应器之间输送试剂以实施以下操作：形成合成模板，从模板实施体外转录以产生治疗性多核苷酸，并纯化治疗性多核苷酸
。
这些方法可以包括通过
PCR
形成合成模板
。
[0013]一种使用包含多于一个流体贮库的系统制备治疗性
mRNA
的方法，所述流体贮库配置为与一个或更多个微流控路径板装置以密封流体连通固定，其中一个或更多个微流控路径板装置包含多于一个反应器，该方法可以包括：将模板前体材料从一个或更多个流体贮库递送到多于一个反应器的第一一个或更多个反应器区域，并处理模板前体材料
(
例如，通过
PCR)
以从模板前体材料制备模板；将模板转移到多于一个反应器的第二一个或更多个反应器区域，并通过体外转录处理模板以形成治疗性
mRNA
；以及将治疗性
mRNA
转移至多于一个反应器的第三一个或更多个反应器区域，并通过在第三一个或更多个反应器区域内的一维
(1D)
或二维
(2D)
纯化来纯化治疗性
mRNA
；其中所有方法步骤都在不使模板和治疗性
mRNA
暴露于大气接触的情况下实施
。
[0014]一种使用系统制备治疗性
mRNA
的方法，所述系统包括与一个或更多个微流控路径板装置密封流体连通的多于一个流体贮库，其中一个或更多个微流控路径板装置包含多于一个反应器，该方法可以包括：使用流体动力将模板前体材料从一个或更多个流体贮库递送到多于一个反应器的第一一个或更多个反应器区域，并处理模板前体材料
(
例如，通过
PCR)
以从模板前体材料制备模板；使用流体动力将模板转移到多于一个反应器的第二一个或更多个反应器区域，并通过体外转录处理模板以形成治疗性
mRNA
；使用流体动力将治疗性
mRNA
转移到多于一个反应器的第三一个或更多个反应器区域，并通过在第三一个或更多个反应器区域内的二维
(2D)
纯化来纯化治疗性
mRNA
；使用流体动力将治疗性
mRNA
转移到多于一个反应器的第四一个或更多个反应器区域，并用递送媒介物包封治疗性
mRNA
以形成治疗性
mRNA
组合物；以及使用流体动力在第五一个或更多个流体贮库中浓缩治疗性
mRNA
组合物，其中所有方法步骤在不使模板和治疗性
mRNA
暴露于大气接触的情况下实施
。
[0015]本文描述了制备方法
(
例如，制备包含适于体外转录的合成
DNA
模板的合成产物的方法
)
，该方法包括：将试剂输送至微流控路径装置中的第一反应器，其中所述本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种制备包含适于体外转录的合成
DNA
模板的合成产物的方法，所述方法包括：将试剂输送至微流控路径装置中的第一反应器，其中所述试剂包括感兴趣的合成基因
、
聚合酶
、
缓冲液
、
具有对所述感兴趣的合成基因特异的第一区域的第一引物
、
和第二引物，其中所述第二引物包含
150
个碱基对
(bp)
或更长的多
T
序列
、
或
150bp
或更长的多
A
序列和对所述感兴趣的合成基因特异的第二区域；控制所述微流控路径装置的所述第一反应器的温度，以在所述微流控路径装置内进行聚合酶链式反应
(PCR)
，以使用所述第一引物和所述第二引物扩增所述感兴趣的合成基因，从而形成包含所述
150bp
或更长的多
A
序列的合成产物；以及将所述合成产物输送出所述第一反应器，其中所述合成产物包含适于体外转录的合成
DNA
模板
。2.
根据权利要求1所述的方法，其中所述第一引物包含与所述感兴趣的合成基因的3’
末端区域的序列互补或包括所述感兴趣的合成基因的3’
末端区域的序列的末端
。3.
根据权利要求2所述的方法，其中与所述感兴趣的合成基因的3’
末端区域的序列互补或包括所述感兴趣的合成基因的3’
末端区域的序列的末端与所述感兴趣的合成基因的
20bp
和
40bp
之间互补或包含所述感兴趣的合成基因的
20bp
和
40bp
之间
。4.
根据权利要求1‑3中任一项所述的方法，其中所述第二引物的所述第二区域包含包括所述感兴趣的合成基因的5’
末端区域或与所述感兴趣的合成基因的5’
末端区域互补的末端区域
。5.
根据权利要求4所述的方法，其中包括所述感兴趣的合成基因的5’
末端区域或与所述感兴趣的合成基因的5’
末端区域互补的末端区域的长度在约
20bp
和约
40bp
之间
。6.
根据权利要求1‑5中任一项所述的方法，其中控制温度以通过
PCR
扩增所述感兴趣的合成基因包括产生大于1μ
M
的扩增
DNA
模板
。7.
根据权利要求1‑6中任一项所述的方法，其中所述合成
DNA
模板不含细菌
DNA
并且不含内毒素
。8.
根据权利要求7所述的方法，还包括用甲基化敏感性限制性内切酶处理所述感兴趣的合成基因
、
所述合成产物或二者以去除细菌
DNA。9.
根据权利要求1‑8中任一项所述的方法，其中所述第一引物包含启动子区域
。10.
根据权利要求1‑9中任一项所述的方法，其中控制温度以通过
PCR
扩增所述感兴趣的合成基因包括进行
20
个和
25
个之间的退火和延伸循环的扩增
。11.
根据权利要求1‑
10
中任一项所述的方法，其中输送所述第一引物包括输送具有
T7
启动子的所述第一引物
。12.
根据权利要求1‑
11
中任一项所述的方法，其中输送所述第二引物包括输送包含
200bp
或更长的多
T
序列或
200bp
或更长的多
A
序列的所述第二引物
。13.
根据权利要求1‑
12
中任一项所述的方法，还包括在控制器中接收来自所述微流控路径装置的一个或更多个传感器的光学传感器数据，其中所述控制器至少使用所述光学传感器数据来控制所述微流控路径装置的操作
。14.
根据权利要求1‑
13
中任一项所述的方法，还包括在所述微流控路径装置中通过一维
(1D)
或二维
(2D)
纯化来纯化所述合成产物
。15.
根据权利要求
14
所述的方法，其中纯化包括去除低于最小长度阈值的多核苷酸
。
16.
根据权利要求
15
所述的方法，其中所述最小长度阈值低于
500bp。17.
根据权利要求1‑
16
中任一项所述的方法，其中输送包括使用一个或更多个流体动力回路在多于一个流体贮库和所述微流控路径装置之间或在所述微流控路径装置内移动所述试剂
。18.
根据权利要求1‑
16
中任一项所述的方法，还包括使用所述合成
DNA
模板进行体外转录以形成治疗性多核苷酸
。19.
根据权利要求1‑
18
中任一项所述的方法，还包括使用所述微流控路径装置上的
UV
产率检测窗来确定所述合成产物的产率
。20.
根据权利要求
19
所述的方法，还包括基于所确定的产率自动稀释所述微流控路径装置中的所述合成产物
。21.
根据权利要求1‑
20
中任一项所述的方法，其中控制温度包括在所述微流控路径装置内的聚合酶链式反应期间添加另外的酶
。22.
一种制备包含
DNA
模板的合成产物的方法，所述方法包括：将试剂输送至微流控路径装置中的第一反应器，其中所述试剂包括感兴趣的合成基因
、
聚合酶
、
缓冲液
、
包含与所述感兴趣的合成基因互补的多核苷酸的第一区域杂交的5’
末端的正向引物
、
和反向引物，其中所述反向引物包含
150bp
或更长的多
T
序列和与所述感兴趣的合成基因的5’
末端互补的5’
区域；控制所述微流控路径装置的所述第一反应器的温度，以在所述微流控路径装置内进行聚合酶链式反应
(PCR)
，以使用所述正向引物和所述反向引物扩增所述感兴趣的合成基因，从而形成包含
150bp

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：胡桃夹子治疗公司，
类型：发明
国别省市：