一种检测基质金属蛋白酶的电化学发光多肽传感方法技术

本发明专利技术属于电化学分析技术领域，涉及一种检测基质金属蛋白酶的电化学发光多肽传感方法，包括：

【技术实现步骤摘要】
一种检测基质金属蛋白酶的电化学发光多肽传感方法


[0001]本专利技术属于电化学分析
，涉及一种检测基质金属蛋白酶的电化学发光多肽传感方法
。

技术介绍

[0002]基质金属蛋白酶
(MMPs)
能降解细胞外基质中的各种蛋白成分，参与细胞外基质的降解和转运
。
基质金属蛋白酶在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，癌症的发生通常与多个
MMPs
的高表达密切相关
。
例如，
MMP
‑2和肿瘤的发生发展以及转移有很大的相关性
。
当人体受到炎症
、
损伤等刺激时，
MMP
‑2在体内的含量就会有显著增加；此外，在海人酸大鼠癫痫模型中大脑中
MMP
‑2被激活，
MMP
‑2被认为是人类癫痫病的潜在生物标志物
。
人们还发现肺气肿
、
慢性阻塞性肺疾病和肺损伤等疾病与多种基质金属蛋白酶
(MMP
‑
2、3、9)
相关，基质金属蛋白酶可直接降解肺内胶原和其它间质组织，导致肺组织破坏
。
因此，对于基质金属蛋白酶的测定对多种疾病的筛查和诊断有指导意义
。
目前，传统的基质金属蛋白酶检测方法，大多采用明胶聚丙烯酰凝胶电泳和酶联免疫吸附法，但是这些检测方法存在预处理繁琐，检测灵敏度低的技术问题
。
[0003]电化学发光生物传感法是将生物识别反应转换为电化学发光信号从而定量分析目标物的分析方法
。
该法具有灵敏度高
、
背景低
、
仪器设备简单等优点，已在临床
、
环境以及食品等领域得到广泛应用
。
目前商品化的电化学发光免疫分析仪及其试剂盒虽然在临床检测上正在逐步替代放射免疫分析法，但是由于电化学发光分析法主要是利用抗原
/
抗体免疫反应的亲合型生物分析法，不能实现切割型酶类物质的检测
。
利用肽为分子识别物质的切割型蛋白酶分析方法，在蛋白酶类物质的检测中得到了人们的关注
。
[0004]具有分子识别和信号转换作用的电化学发光信号探针的合成及性能研究是电化学发光生物传感的关键
。
目前公开的电化学发光生物传感检测蛋白酶的研究中，所使用的电化学发光探针在制备时通常基于共价耦合或将电化学发光信号物质嵌入双链
DNA
等分子识别物质中获得
。
目前应用于蛋白酶检测的电化学发光探针的合成，具有一定的局限性
。
例如，共价标记通常需要将电化学发光信号物质共价标记在小分子肽链末端的巯基或氨基上获得，导致对目标物质识别时识别能力降低，信号物质的电化学发光效率也降低，降低了蛋白酶检测的灵敏度；且共价标记肽链时，一般需要额外的偶联试剂，操作步骤繁琐，标记速度慢
。
嵌入式标记一般是将信号物质嵌入双链
DNA
中，需要设计与肽链偶联的
DNA。
因此，开发出一种新型的具有高发光效率和高识别能力的电化学发光探针合成策略，建立快速灵敏高选择性的检测蛋白酶的分析方法，对疾病筛查
、
早期诊断和预后评价等具有重要意义
。

技术实现思路

[0005]为了解决上述现有技术中存在电化学发光效率低
、
检测灵敏度低以及操作繁琐的技术问题，本专利技术提供一种检测基质金属蛋白酶的电化学发光多肽传感方法
。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提出一种溶剂化环铱金属配合物
(
下称铱金属配合
物
)
，与含有组氨酸的肽链通过配位作用标记肽链后得到电化学发光探针，利用“一锅”孵育实现基质金属蛋白酶检测，具有探针合成操作便捷
、
标记快速
、
反应条件温和及检测方法灵敏度高和易于操作的优点
。
本专利技术采用的方案具体如下：
[0007]一种检测基质金属蛋白酶的电化学发光多肽传感方法，包括以下步骤：
[0008]取肽链溶液
、
铱金属配合物溶液
、
磁性微粒
MB@SA
悬浮液混合，加入基质金属蛋白酶标准溶液，再用
PB
缓冲溶液定容后，恒温孵育混合物，得到磁珠复合物；
[0009]2)
测定电化学发光强度
[0010]利用磁场作用将磁珠复合物富集到磁性玻碳电极表面，将其置于电解液中，采用循环伏安法测定磁珠复合物对应的电化学发光强度；
[0011]3)
获得标准回归方程
[0012]3.1)
参照步骤
1)
改变加入基质金属蛋白酶标准溶液的体积，得到含有不同浓度基质金属蛋白酶的磁珠复合物；参照步骤
2)
得到不同浓度基质金属蛋白酶反应后的磁珠复合物对应的电化学发光强度；
[0013]3.2)
以基质金属蛋白酶浓度作为横坐标，磁珠复合物对应的电化学发光强度为纵坐标，线性回归得到标准回归方程：
[0014](I0‑
I)
＝
aC
MMP
+b
；
[0015]其中：
[0016]I0为基质金属蛋白酶含量为0时混合物反应后得到磁珠复合物对应的电化学发光强度；
[0017]I
为不同基质金属蛋白酶含量时混合物反应后得到磁珠复合物对应的电化学发光强度；
[0018]C
MMP
为基质金属蛋白酶的浓度，
ng/mL
；
[0019]a、b
均为常数；
[0020]4)
测定待测样品的基质金属蛋白酶浓度
[0021]取待测样品，按照步骤
1)
～步骤
2)
的方法，得到待测样品混合物反应后得到的磁珠复合物对应的电化学发光强度，代入步骤
3)
的标准回归方程中，反推得到待测样品中基质金属蛋白酶浓度
。
[0022]进一步限定，所述步骤
1)
中，所述肽链溶液
、
铱金属配合物溶液和磁性微粒
MB@SA
悬浮液的体积比为
3.2
：
2.5
：5；用
PB
缓冲溶液定容后的总体积与铱金属配合物溶液的体积比为
100
：
3。
[0023]进一步限定，所述步骤
1)
中，所述
PB
缓冲溶液浓度为
10mmol/L
；所述肽链溶液是含
1mg/mL
标准肽链的
PB
缓冲溶液；所述磁性微粒
MB@SA
悬浮液是含
2.5mg/mL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种检测基质金属蛋白酶的电化学发光多肽传感方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)“一锅”孵育取肽链溶液
、
铱金属配合物溶液
、
磁性微粒
MB@SA
悬浮液混合，加入基质金属蛋白酶标准溶液，再用
PB
缓冲溶液定容后，恒温孵育混合物，得到磁珠复合物；
2)
测定电化学发光强度利用磁场作用将磁珠复合物富集到磁性玻碳电极表面，将其置于电解液中，采用循环伏安法测定磁珠复合物对应的电化学发光强度；
3)
获得标准回归方程
3.1)
参照步骤
1)
改变加入基质金属蛋白酶标准溶液的体积，得到含有不同浓度基质金属蛋白酶的磁珠复合物；参照步骤
2)
得到不同浓度基质金属蛋白酶反应后的磁珠复合物对应的电化学发光强度；
3.2)
以基质金属蛋白酶浓度作为横坐标，磁珠复合物对应的电化学发光强度为纵坐标，线性回归得到标准回归方程：
(I0‑
I)
＝
aC
MMP
+b
；其中：
I0为基质金属蛋白酶含量为0时混合物反应后得到磁珠复合物对应的电化学发光强度；
I
为不同基质金属蛋白酶含量时混合物反应后得到磁珠复合物对应的电化学发光强度；
C
MMP
为基质金属蛋白酶的浓度，
ng/mL
；
a、b
均为常数；
4)
测定待测样品的基质金属蛋白酶浓度取待测样品，按照步骤
1)
～步骤
2)
的方法，得到待测样品混合物反应后得到的磁珠复合物对应的电化学发光强度，代入步骤
3)
的标准回归方程中，反推得到待测样品中基质金属蛋白酶浓度
。2.
根据权利要求1所述的一种检测基质金属蛋白酶的电化学发光多肽传感方法，其特征在于，所述步骤
1)
中，所述肽链溶液
、
铱金属配合物溶液和磁性微粒
MB@SA
悬浮液的体积比
3.2
：
2.5
：5；用
PB
缓冲溶液定容后的总体积与铱金属配合物溶液的体积比为
100
：
3。3.
根据权利要求2所述的一种检测基质金属蛋白酶的电化学发光多肽传感方法，其特征在于，所述步骤
1)
中...

【专利技术属性】
技术研发人员：漆红兰，千曼萍，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：