神经胚素变体制造技术

公开了在选定的氨基酸残基具有取代的变体神经胚素多肽。在一或多个选定的氨基酸残基的取代减少变体神经胚素多肽的肝素结合并增加其血清暴露。还公开了利用变体神经胚素多肽治疗疾病以及活化哺乳动物中的ＲＥＴ受体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及蛋白质化学，分子生物学和神经生物学。
技术介绍
神经胚素也已知为Artemin和Enovin，其为24-kDa同源二聚体分泌型 蛋白，促进外周和中央神经系统神经元诸如多巴胺能神经元的存活(Baudet et al., 2000, Development, 127:4335; Rosenblad et al" 2000, Mol. Cell Neurosci" 15(2):199; GenBank AF120274)。编码神经胚素的基因已经被克隆并测序 (Roseblad et al" 2000, Mol. Cell Neurosci" 15(2): 199; Baloh et al" Neuron， 21:1291)。在细胞水平，GDNF成员活化受体酪氨酸激酶RET。 RET结合共同受体 GDNF家族受体alpha(GFRalpha)，其为糖基磷脂酰肌醇(GPI)连接型膜蛋白， 提供对RET的配体特异性。已知四种GFRalpha(GFRalphal-4)。神经胚素结 合GFRalpha3,与RET —起形成三元信号复合体(Baudet et al. 2000, Development, 127:4335; Baloh et al" 1998, Neuron, 21:1291),其主要定位于 痛觉感觉神经元上(Orozco etal., 2001, Eur. J. Neurosci., 13(11):2177)。这些神 经元检测痛觉和损伤。因此，神经胚素在临床上可用于神经病的一般治疗 并更具体地用于治疗神经病性疼痛。神经胚素和其它GDNF家族成员是转化型生长因子beta (TGF beta)超家 族成员，并由此其特征在于存在7个具有相似间隔的保守的半胱氨酸残基， 其形成半胱氨酸结的结构(Saarma, 1999, Microsc. Res. Tech,, 45:292)。每个单体含有这样的两个二硫键，其形成封闭的环结构，包绕第三个二硫键以形 成紧实的结状结构。每个单体中所含的第七个半胱氨酸形成分子间二硫键，其共价连接所述单体形成最终的二聚体产物(Rattenholl et al 2000, J. Mol. Biol" 305:523)。TGF beta家族成员作为前原蛋白合成，所述蛋白在切割信号肽和原结 构域以后最终作为成熟同源二聚体分泌(见例如Rattenholl， et al., 2000， J. Mol. Biol" 305:523; Fairlie et al., 2001, J. Biol. Chem., 276(20): 16911)。信号肽 和原结构域介导TGF beta家族成员的正确分泌(Rattenholl et al., 2000， J. Mol. Biol" 305:523; Rattenholl et al" 2001, Eur. J. Biochem.， 268:3296)。
技术实现思路
本专利技术至少部分基于以下发现神经胚素结合^^酸肝素以及神经胚素多肽中的特定氨基酸残基对该结合事件有贡献。发现所选氨基酸残基的取 代减少变体神经胚素多肽与肝素的结合并增加该变体的生物活性和生物利 用度。一方面，本专利技术的特征在于这样的多肽，其包含与SEQ ID NO:l的氨 基酸15-113具有至少80%同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列相 对于SEQ ID NO:l包含至少一处氨基酸取代，所述氨基酸选自下组氨基 酸，其不同于位于SEQIDNO:l的位置48的相应位置的精氨酸(例如，精氨 酸被非保守氨基酸残基诸如谷氨酸取代)；氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:l的位置49的相应位置的精氨酸(例如，精氨酸被非保守氨基酸残基诸 如谷氨酸取代)；和氨基酸，其不同于位于SEQIDNO:l的位置51的相应位 置的精氨酸(例如，精氨酸被非保守氨基酸残基诸如谷氨酸取代)。所述多肽 在二聚化时结合含有GFRalpha3和RET的复合体。一些实施方案中，所迷氨基酸序列含有这样的氨基酸，其不同于位于 与SEQ ID NO:l的位置48和49相对应位置的精氨酸。例如，SEQ ID NO:l 的位置48的精氨酸和位置49的精氨酸可被非保守氨基酸(例如谷氨酸)取 代。一些实施方案中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:l的氨基酸15-113 具有至少90 % ,至少95 %或至少98 %的同 一性。还公开了含有SEQ ID NO:2的氨基酸15-113, SEQ ID NO:3的氨基酸 15-113, SEQ ID NO:4的氨基酸15-113， SEQ ID NO:5的氨基酸15-113, SEQIDNO:8的氨基酸15-113,或SEQIDNO:9的氨基酸15-113的多肽。一些实 施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸10-113, SEQ ID NO:3的氨 基酸10-113, SEQ ID NO:4的氨基酸10-113, SEQ ID NO:5的氨基酸10-113， SEQ ID NO:8的氨基酸10-113,或SEQ ID NO:9的氨基酸10-113。 一些实 施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，SEQ ID NO:3的氨基 酸序列，SEQ ID NO:4的氨基酸序列,SEQ ID NO:5的氨基酸序列，SEQ ID NO:8的氨基酸序列，或SEQIDNO:9的氨基酸序列。还公开了包含与SEQIDNO:l的氨基酸15-113具有至少80%同一性的 氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:l包含至少一 处氨基酸取代，所述氨基酸选自下组(i)氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:l的位置20的相应位置的丝氨酸(例如，丝氨酸被非保守氨基酸残基取代)；(ii) 氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:l的位置21的相应位置的谷氨酰胺(例 如，谷氨酰胺被非保守氨基酸残基取代)；(iii)氨基酸，其不同于位于SEQID NO:l的位置32的相应位置的组氨酸(例如，组氨酸被非保守氨基酸残基取 代)；(iv)氨基酸，其不同于位于SEQIDNO:l的位置33的相应位置的精氨 酸(例如精氨酸被非保守氨基酸残基取代)；(v)氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:l的位置39的相应位置的精氨酸(例如精氨酸被非保守氨基酸残基取代); (vi)氨基酸，其不同于位于SEQIDNO:l的位置46的相应位置的丝氨酸(例 如丝氨酸被非保守氨基酸残基取代)；(vii)氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:l的位置68的相应位置的精氨酸(例如精氨酸被非保守氨基酸残基取代); (viii)氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO: 1的位置72的相应位置的甘氨酸(例 如甘氨酸被非保守氨基酸残基取代)；(ix)氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:l的位置73的相应位置的丝氨酸(例如丝氨酸被非保守氨基酸残基取代); 和(x)氨基酸，其不同于位于SEQ ID NO:l的位置94的相应位置的缬氨酸(例 如缬氨酸被非保守氨基酸残基取代)。所述多肽在二聚化时结合含有 GFRalpha3和RET的复合体。 一些实施方案中，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:l的氨基本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含与ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１的氨基酸１５－１１３具有至少８０％同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列相对于ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１包含至少一处氨基酸取代，所述氨基酸选自下组：　　　　氨基酸，其不同于位于ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１的位置４８的相应位置的精氨酸；　　　　氨基酸，其不同于位于ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１的位置４９的相应位置的精氨酸；和　　　　氨基酸，其不同于位于ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：１的位置５１的相应位置的精氨酸，　　　　其中所述多肽在二聚化时结合含有ＧＦＲａｌｐｈａ３和ＲＥＴ的复合体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：安东尼罗索曼多，劳拉西尔维安，R布莱克佩平斯基，
申请(专利权)人：比奥根艾迪克MA公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]