肝血管肉瘤标志物的筛选方法及其在制备肝血管肉瘤诊断试剂盒中的应用技术

本发明专利技术属于生物医学技术领域，具体涉及一种肝血管肉瘤标志物的筛选方法及其在制备肝血管肉瘤诊断试剂盒中的应用

【技术实现步骤摘要】
肝血管肉瘤标志物的筛选方法及其在制备肝血管肉瘤诊断试剂盒中的应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种肝血管肉瘤标志物的筛选方法及其在制备肝血管肉瘤诊断试剂盒中的应用
。

技术介绍

[0002]肝血管肉瘤又称血管内皮细胞肉瘤或恶性血管内皮瘤，是肝脏血管源性恶性肿瘤中最常见的一种，约占同期肝脏恶性肿瘤检出率的
0.69
％，多发于男性，男女之比约3～
5.5
；1，常见于老年人，平均发病年龄
52
岁
。
肝血管肉瘤目前具体发病机制不清楚，可能与饮水中含有无机砷
、
单胺氧化酶抑制剂等有关
。
主要临床表现为腹痛
、
厌食
、
恶心
、
体重减轻
、
发热等，肝肿大
,
晚期黄疸
、
血性腹水等
。
肝血管肉瘤恶性程度高，病程进展快，其治疗方式主要采用放化疗，化疗敏感药物主要包括氟尿嘧啶
、
长春新碱
、
环磷酰胺
、
多柔比星
、
表柔比星，肿瘤切除机会少，有报道显示未正规治疗的病人大多数于6～
12
个月内死亡，多死于肝功能衰竭或腹腔内出血
。
[0003]目前，越来越多的人已经认识到整合不同水平的数据是诊断早期肝血管肉瘤生物标志物的重要方法
。
近年来，蛋白质组学作为系统生物学的重要组成部分，结合模式识别方法，可用于判断生物体的病理生理状态，因此被广泛运用于疾病研究中
。
液相色谱
‑
质谱串联技术是蛋白质组学的主要研究手段，前列腺癌的诊断标志物肌氨酸的检测
、
新生儿疾病筛查时的多种氨基酸检测等均是代谢小分子在疾病诊断中应用的已有成功案例
。
因此，寻找新的可以诊断肝血管肉瘤的代谢标志物具有十分重要的意义
。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的之一是提供一种肝血管肉瘤标志物的筛选方法，本专利技术采用质谱分析的方法检测小分子的含量，该方法简单，实用，且通过多种小分子的检测可以更好地提高检测方法的灵敏度与特异性
。
[0005]为实现上述目的，本专利技术肝血管肉瘤标志物的筛选方法采取下述技术方案：
[0006]一种肝血管肉瘤标志物的筛选方法，包括如下步骤：
[0007](1)
提取分子产物，将保存于
‑
80℃
下的血液样本解冻后，采用
4℃
下的
PBS
清洗，然后，加入
ddH2O
进行匀浆，涡旋，加入甲醇和乙腈溶液，涡旋，超声，再置于
‑
20℃
下孵育后，
4℃
下离心，将上清真空冷冻干燥，最后，将冻干粉置于
‑
80℃
下保存，备用；
[0008](2)LC
‑
MS/MS
质谱分析，将上述冻干粉用体积比为
1:1
的乙腈和水溶液复溶后，采用超高效液相色谱系统分离，然后采用质谱仪
I
进行检测分析；
[0009](3)
数据处理，样本检测完毕后，采用质谱仪
II
鉴定分子产物，同时采集血液样品的一级质谱谱图和二级质谱谱图；
[0010](4)
统计学分析，根据
OPLS
‑
DA
模型，以
VIP>1
为筛选标准，初步筛选出差异分子产物；然后，采用多维度统计分析方法，选择
VIP>1、Fold change>2
或
<0.5
的分子产物作为具
有显著性差异的蛋白质
。
[0011]优选地，步骤
(2)
中，所述超高效液相色谱的参数设置为：柱温为
25℃、
流速为
0.3mL/min、
上样量为2μ
L
；流动相由两相组成，其中，流动相
A
为含有
25mM
乙酸铵和
25mM
氨水的水溶液，流动相
B
为纯乙腈；样品采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱程序为：0～
0.5min
，
95
％ B
；
0.5
～
7min
，
95
％
B
～
65
％
B
；7～
8min
，
65
％
B
～
50
％
B
；8～
9min
，
50
％
B
；9～
9.1min
，
50
％
B
～
95
％
B
；
9.1
～
12min
，
95
％
B
；上述过程中样品均置于
4℃
下
。
[0012]优选地，步骤
(2)
中，所述质谱仪
I
在
ESI
正离子模式下进行，
ESI
源的参数设置为：
Drying gas
流速，
16L/min
；
Gas
温度，
250℃
；
Sheath gas
温度，
500℃
；
sheath Gas
流速，
12L/min
；
Nebulizer
，
20psig
；
Vcap
，
3000V
；
Nozzle
电压，
175V
；
Mass Range
，
50
～
1200Da
；
Acquisition rate
，
4HZ
；每个循环的时间，
50ms。
[0013]优选地，步骤
(3)
中，所述质谱仪
II
的
ESI
源参数设置为：
Ion Source Gas1
，
50
；
Ion Source Gas2
，
80
；
source temperature
，
650℃
；
Curtaingas
，
30
；
Io本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种肝血管肉瘤标志物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)
提取分子产物，将保存于
‑
80℃
下的血液样本解冻后，采用
4℃
下的
PBS
清洗，然后，加入
ddH2O
进行匀浆，涡旋，加入甲醇和乙腈溶液，涡旋，超声，再置于
‑
20℃
下孵育后，
4℃
下离心，将上清真空冷冻干燥，最后，将冻干粉置于
‑
80℃
下保存，备用；
(2)LC
‑
MS/MS
质谱分析，将上述冻干粉用体积比为
1:1
的乙腈和水溶液复溶后，采用超高效液相色谱系统分离，然后采用质谱仪
I
进行检测分析；
(3)
数据处理，样本检测完毕后，采用质谱仪
II
鉴定分子产物，同时采集血液样品的一级质谱谱图和二级质谱谱图；
(4)
统计学分析，根据
OPLS
‑
DA
模型，以
VIP>1
为筛选标准，初步筛选出差异分子产物；然后，采用多维度统计分析方法，选择
VIP>1、Fold change>2
或
<0.5
的分子产物作为具有显著性差异的蛋白质
。2.
根据权利要求1所述的肝血管肉瘤标志物的筛选方法，其特征在于，步骤
(2)
中，所述超高效液相色谱的参数设置为：柱温为
25℃、
流速为
0.3mL/min、
上样量为2μ
L
；流动相由两相组成，其中，流动相
A
为含有
25mM
乙酸铵和
25mM
氨水的水溶液，流动相
B
为纯乙腈；样品采用梯度洗脱的方式进行洗脱，洗脱程序为：0～
0.5min
，
95
％
B
；
0.5
～
7min
，
95
％
B
～
65
％
B
；7～
8min
，
65
％
B
～
50
％
B
；8～
9min
，
50
％
B
；9～
9.1min
，
50
％
B
～
95
％
B
；
9.1
～
12min
，
95
％
B
；上述过程中样品均置于
4℃
下
。3.
根据权利要求1所述的肝血管肉瘤标志物的筛选方法，其特征在于，步骤
(2)
中，所述质谱仪
I
在
ESI
正离子模式下进行，
ESI
源的参数设置为：
Drying gas
流速，
16L/min
；
Gas
温度，
250℃
；
Sheath gas
温度，
500℃
；
sheath Gas
流速，
12L/min
；
Nebulizer
，
20psig
；
Vcap
，
3000V
；
Nozzle
电压，
175V
；
Mass Range
，
50
～
1200Da
；
Acquisition rate
，
4HZ
；每个循环的时间，
50ms。4.
根据权利要求1所述的肝血管肉瘤标志物的筛选方法，其特征在于，步骤
(3)
中，所述质谱仪
II
的

【专利技术属性】
技术研发人员：何玉婷，薛晨，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：