番茄制造技术

本发明专利技术公开了一种番茄

【技术实现步骤摘要】
番茄SlSUVH1基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，特别是涉及一种番茄
SlSUVH1
基因在调控植物抗病毒中的应用及转基因植物培育方法
。

技术介绍

[0002]番茄黄化曲叶病毒
(tomato yellow leaf curl virus
，
TYLCV)
属于双生病毒科，菜豆金色花叶病毒属，是目前研究最多的植物病毒之一，同时也是对全球番茄生产危害最大的病毒
。
流行时可造成农作物的产量和品质下降，对农业经济造成严重损失
。
[0003]TYLCV
在自然界中主要通过烟粉虱进行传播，传播
TYLCV
的烟粉虱主要有
B
型和
Q
型，并且
Q
型烟粉虱的传毒效率比
B
型高
。
除了介体传播外，
TYLCV
可以通过嫁接传播
。TYLCV
侵染植物后会使植物生长缓慢，造成植株矮化，还会使叶片卷曲
、
黄化和皱缩
。
[0004]利用抗病基因防控双生病毒是农业生产中有效
、
绿色的病毒病害防控方法
。
然而，由于目前生产上可用的商业化品种具有的抗性基因有限，同时田间病毒的复合侵染会导致抗病基因介导的抗性损失
。
通过利用隐性抗病基因
(
也叫绿色抗病突变体
)
：即该基因在病毒侵染中具有重要功能，敲除或者缺失该基因会严重抑制病毒的复制
、
转录
、
翻译或移动等病毒的必要生命过程，但是该基因的敲除或者缺失不会影响植物的生长
、
发育与繁殖
。
由于隐性抗病基因介导的抗性具有重要的应用价值，因此利用该类基因传递对病毒的抗性具有重要意义
。
[0005]本专利技术通过前期研究发现
SlSUVH1
基因能够促进双生病毒的侵染，因此通过利用这个基因，构建和培育其绿色突变体，可实现对双生病毒的有效防控
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一目的是提供一种番茄
SlSUVH1
基因在调控植物抗病毒中的应用
。
[0007]本专利技术的第二目的是提供一种番茄
SlSUVH1
基因敲除的转基因植物的培育方法
。
[0008]本专利技术发现了番茄中
SlSUVH1
基因是一个感病基因
。
通过农杆菌转化的方法，将携带
SlSUVH1
靶点的
CRISPR
载体导入目的植物中，获得的番茄
SlSUVH1
基因敲除植物能够显著减轻
TYLCV
的侵染，有效控制该病毒的危害
。
[0009]具体而言，本专利技术采用的技术方案具体如下：
[0010]番茄
SlSUVH1
基因在调控植物抗病毒中的应用，其中，所述病毒为番茄黄化曲叶病毒
TYLCV。
所述
SlSUVH1
基因的转录本序列如
SEQ ID NO:1
所示，所述植物为番茄
。
[0011]具体的，通过构建番茄基因
SlSUVH1
敲除载体，即：针对番茄
SlSUVH1
基因编码区具备
PAM
位点设计相应的特异性靶向
sgRNA
，构建到骨架载体
BKG
质粒上；以无菌培养的番茄叶片做愈伤组织，使用农杆菌介导的
T
‑
DNA
方式进行遗传转化，将敲除载体导入目的植物中，获得的番茄
SlSUVH1
基因突变的纯合植物能够显著减轻番茄黄化曲叶病毒的侵染
。
[0012]一种抗番茄黄化曲叶病毒的
SlSUVH1
转基因植物的培育方法：通过叶盘法，将携带
SlSUVH1
基因靶点的基因敲除载体导入目的植物中，获得番茄
SlSUVH1
基因突变的纯合植物
。
[0013]具体包括以下步骤：
[0014](1)
分别对
SlSUVH1
两个拷贝基因公共保守区域进行
CRISPR
靶点筛选，得到
gRNA
靶点序列，如
SEQ ID NO:2
所示；设计引物进行
PCR
扩增，克隆得到
SlSUVH1
‑
gRNA
‑
gRNA
片段；引物为
SlSUVH1
‑
gRNA
‑
F
和
SlSUVH1
‑
gRNA
‑
R
，序列分别如
SEQ ID NO:3
‑4所示；
[0015](2)
将
SlSUVH1
‑
gRNA
‑
gRNA
构建到带有
CRISPR
‑
Cas9
载体上，获得重组质粒；
[0016](3)
将1μ
l
重组质粒与
100
μ
l
农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置
2500V
电击转化，恢复后涂布到抗性培养基上筛选获得带有
CRISPR
‑
Cas9
重组质粒的农杆菌；
[0017](4)
将带有重组质粒的农杆菌侵染番茄叶片，经分化培养获得愈伤组织，再经生根培养获得小苗，转移继续培养；
[0018](5)
小苗生长稳定后，取叶片样品，使用
CTAB
法抽提
DNA
；利用引物对
M13
‑
F
与
BKG
‑
gRNA
‑
R
，以提取
DNA
为模板进行
PCR
扩增，确定植物中转入了外源
CRISPR
‑
Cas9
序列；所述
M13
‑
F
和
BKG
‑
gRNA
‑
R
的序列如
SEQ ID NO:5
‑6所示；
[0019](6)
在阳性转基因材料上，使用引物
BKG
‑
SlSUVH1
‑
F
与
BKG
‑
SlSUVH1
‑
R
克隆番茄
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
番茄
SlSUVH1
基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：所述病毒为番茄黄化曲叶病毒；所述
SlSUVH1
基因的转录本序列如
SEQ ID NO:1
所示
。2.
根据权利要求1所述番茄
SlSUVH1
基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：所述植物为番茄
。3.
根据权利要求2所述番茄
SlSUVH1
基因在调控植物抗病毒中的应用，其特征在于：采用农杆菌介导的
T
‑
DNA
方式进行遗传转化，将基因敲除载体导入目的植物中，获得的番茄
SlSUVH1
敲除植株能够显著减轻番茄黄化曲叶病毒的侵染
。4.
一种抗番茄黄化曲叶病毒的
SlSUVH1
转基因植物的培育方法，其特征在于：使用农杆菌介导的
T
‑
DNA
方式进行遗传转化，将基因敲除载体导入目的植物中，获得的番茄
SlSUVH1
敲除植株，所述
SlSUVH1
基因的转录本序列如
SEQ ID NO:1
所示
。5.
根据权利要求4所述的
SlSUVH1
转基因植物的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)
分别对
SlSUVH1
两个拷贝基因公共保守区域进行
CRISPR
靶点筛选，得到
gRNA
靶点序列，如
SEQ ID NO:2
所示；设计引物进行
PCR
扩增，克隆得到
SlSUVH1
‑
gRNA
‑
gRNA
片段；
(2)
将
SlSUVH1
‑
gRNA
‑
gRNA
构建到带有
CRISPR
‑
Cas9
载体上，获得重组质粒；
(3)
将1μ
l
重组质粒与
100
μ
l
农杆菌感受态混合转入电击杯中，使用电击装置
2500V
电击转化，恢复后涂布到抗性培养基上筛选获得带有
CRISPR
‑
Cas9
重组质粒的农杆菌；
(4)
将带有重组质粒的农杆菌侵染番茄叶片，经分化培...

【专利技术属性】
技术研发人员：李方方，周雪平，刘贺，龚攀，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：