一种定量检测微量末梢血样本中制造技术

本发明专利技术公开了一种定量检测微量末梢血样本中

【技术实现步骤摘要】
一种定量检测微量末梢血样本中25
‑
羟基维生素D的方法


[0001]本专利技术涉及
25
‑
羟基维生素
D
检测
，更具体地说，涉及一种定量检测微量末梢血样本中
25
‑
羟基维生素
D
的方法
。

技术介绍

[0002]维生素
D
是一种脂溶性维生素，主要包括维生素
D2
和维生素
D3,
维生素
D
在调剂人体血清钙
、
磷水平中具有重要生理学作用
。
维生素
D2
主要由植物中的麦角固醇经阳光照射而合成的
。
维生素
D3
可由人体皮肤细胞中的7‑
脱氢胆固醇经紫外线照射后进行光化学反应转变得到，也可通过食物摄取
。
维生素
D
在肝脏经
25
羟化酶催化变成
25
‑
羟基维生素
D
，经肾脏的1羟化酶催化，最终生成
1,25
‑
二羟基维生素
D
，这是体内维生素
D
主要的生物活性代谢物
。1,25
‑
二羟基维生素
D
可以调节小肠等对钙的吸收
。
由于
1,25
‑
二羟基维生素
D
体内含量低
、
半衰期短，该代谢物浓度检测只适用于一定的疾病状态
。25
‑
羟基维生素
D
含量高
、
半衰期长
、
稳定性好，美国内分泌学会临床实践指南推荐检测
25
‑
羟基维生素
D
水平以评估人体内维生素
D
水平
。
[0003]传统的
25
‑
羟基维生素
D
检测方法有放射免疫法
、
竞争蛋白结合法
、
化学发光免疫测定法等
。
但是主要存在如下问题：有的方法有放射性污染风险；有的方法前处理复杂
、
耗时长；有的方法特异性不足；不能同时准确定量
25
‑
羟基维生素
D2
和
25
‑
羟基维生素
D3
的含量
。
采用液相色谱
‑
串联质谱法，在多反应监测扫描模式下，可同时检测
25
‑
羟基维生素
D2
和
25
‑
羟基维生素
D3
，具有非常高的灵敏度
、
特异性和准确性
。
[0004]采用液相色谱
‑
串联质谱法检测内源性生物标志物，最根本的挑战来源于其内源性的特点
。
一般的基于液相色谱
‑
串联质谱的生物分析方法需采用不含分析物的空白基质用于配制校正标样和质量控制样本，生物基质中原本存在的内源性分析物可能使分析方法更加复杂，从而导致准确度和精密度下降
。
如何克服内源性分析物的干扰和波动是准确检测内源性生物标志物的最重要因素之一
。
现阶段维生素
D
检测主要检测血清样本中的
25
‑
羟基维生素
D2
和
25
‑
羟基维生素
D3。
一般采用一定浓度的牛血清白蛋白
(BSA)
作为替代基质进行血清中
25
‑
羟基维生素
D2
和
25
‑
羟基维生素
D3
的检测
。
现阶段
25
‑
羟基维生素
D
的参考范围也是基于血清样本的检测值建立
。
但是对于低龄儿童人群，由于采集静脉血比较困难，临床上往往采用采集指尖末梢血作为替代方案
。
采用指尖末梢血进行
25
‑
羟基维生素
D
的检测存在以下几个困难，一是采血量较少，一般一次在
100
微升左右；二是全血中血清的含量存在个体差异，即受红细胞压积
(HCT)
的影响；三是全血中的基质更加复杂，采用
BSA
作为替代基质很难准确定量
。
因此，准确的检测微量末梢血中的
25
‑
羟基维生素
D
存在巨大的挑战
。
[0005]现有的测定末梢血中
25
‑
羟基维生素
D
的方法，
CN113075305A
公开了一种定量检测末梢血样本中脂溶维生素含量的方法，所述的脂溶性维生素包括维生素
A
，维生素
D2/D3
，维生素
E。
根据公开的质谱离子对信息，该专利技术所述维生素
D2/D3
实际为
25
‑
羟基维生素
D2/D3。
根据实施例1中描述，采用
PBS
作为替代基质用来稀释配制标准曲线
。PBS
与末梢血
(
或全血
)
样本差别显著，在定量检测上存在显著的基质差异
。
另外的，
CN110208435B
公开了一种同时
检测人末梢血中
25
‑
羟基维生素
D3
和
25
‑
羟基维生素
D2
含量的方法
。
根据该专利技术权利要求
3、
权利要求4及实施例9所述，该专利技术实际上检测的是末梢血经过离心得到的上清液
(
血清或血浆
)
，而非直接检测末梢血样本
。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种定量检测微量末梢血样本中
25
‑
羟基维生素
D(25(OH)VD)
的方法，解决了无法获得空白末梢血基质的难题，同时也解决了采用牛血清白蛋白
(BSA)
替代基质与实际样品存在显著基质效应差异的问题
。
[0007]本专利技术技术方案提供一种定量检测微量末梢血样本中
25
‑
羟基维生素
D(25(OH)VD)
的方法，所测的
25
‑
羟基维生素
D
为
25
‑
羟基维生素<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种定量检测微量末梢血样本中
25
‑
羟基维生素
D
的方法，其特征在于，所测的
25
‑
羟基维生素
D
为
25
‑
羟基维生素
D2
和
25
‑
羟基维生素
D3
，
25
‑
羟基维生素
D3
的替代分析物为
25
‑
羟基维生素
D3
‑
d3
，
25
‑
羟基维生素
D2
的替代分析物为
25
‑
羟基维生素
D2
‑
d6
，内标为
25
‑
羟基维生素
D3
的同位素内标
,
具体形式为
25
‑
羟基维生素
D3
‑
d6
，该检测方法包括如下步骤：
S1
，配制标曲工作液和质控工作液：用
1.0mg/mL 2,6
‑
二
‑
叔丁基对甲酚的甲醇溶液溶解准确称量的
25
‑
羟基维生素
D2
‑
d6
，
25
‑
羟基维生素
D3
‑
d3
得到对应的标准品储备液，并稀释得到不同浓度的标曲工作液和质控工作液；
S2
，配制内标工作液：用
1.0mg/mL 2,6
‑
二
‑
叔丁基对甲酚的甲醇溶液溶解准确称量的
25
‑
羟基维生素
D3
‑
d6
得到
1.0mg/mL
的同位素内标储备液，然后用
1.0mg/mL 2,6
‑
二
‑
叔丁基对甲酚的甲醇溶液将上述同位素内标储备液稀释成
25ng/mL
的内标工作液；
S3
，样品处理：取5μ
L
标曲工作液及质控工作液到
2mL96
孔板，加入
95
μ
L
全血基质；取
95
μ
L
末梢血样本到
2mL96
孔板，加入5μ
L
甲醇；以上样本混匀加入
100
μ
L
内标工作液，涡旋后离心，再加入萃取剂进行萃取，涡旋后离心取上清液，氮气吹干后用复溶剂复溶离心后取上清液备用；
S4
，采用液相色谱
‑
串联质谱对待检测上清液进行检测和分析
。2.
根据权利要求1所述的一种定量检测微量末梢血样本中
25
‑
羟基维生素
D
的方法，其特征在于，
S3
中所述萃取剂为正己烷，所述复溶剂为甲醇
、
乙腈和水，且甲醇
:
乙腈
:
水为
4:4:2。3.
根据权利要求1所述的一种定量检测微量末梢血样本中
25
‑
羟基维生素
D
的方法，其特征在于，
S3
中样品处理过程为：
A1
：取5μ
L
标准曲线及质控样本到
2mL96
孔板，加入
95
μ
L
全血基质；取
95
μ
L
末梢血样本到
2mL96
孔板，加入5μ

【专利技术属性】
技术研发人员：吴谦，刘影，祖琴琴，安素芳，蒋艳鑫，刘菲，张倩，王旭，
申请(专利权)人：合肥谱佳医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：