一种血清中制造技术

本发明专利技术提出了一种血清中

【技术实现步骤摘要】
一种血清中IgG糖肽的PRM定量方法及其应用


[0001]本专利技术涉及糖蛋白质组学
，尤其涉及一种血清中
IgG
糖肽的
PRM
定量方法及其应用
。

技术介绍

[0002]免疫球蛋白是一类具有抗体活性的可溶性血清糖蛋白，人类免疫球蛋白根据重链的差异分为
IgG、IgM、IgA、IgE
和
IgD
，
IgG
是血清中含量最多的免疫球蛋白，约占人血清免疫球蛋白的
80
％
。
根据
IgG
γ
链序列和二硫键位置的不同，人类血清中的
IgG
包括
IgG1
‑4四种亚型
。IgGFc(
结晶段
)
和
Fab(
抗原结合段
)
均含有保守的
N
‑
糖基化修饰，
IgG
糖链在维持
IgG
的结构
、
稳定性和生物活性功能中扮演重要角
。
此外，
IgG
型单克隆抗体
(mab)
是一类重要的治疗蛋白，用于治疗癌症
、
自身免疫性疾病和感染性疾病
。IgGN
‑
糖基化修饰的改变与癌症
、
肝纤维化等多种疾病的发生发展密切相关，也直接影响
IgG
型单克隆抗体药物的活性及功能
。
因此，对
IgG N
‑
糖基化修饰准确定量研究对疾病的诊断和治疗具有重要意义
。
[0003]近年来，研究者们一直致力于发展
IgG N
‑
糖基化定量方法，以提高复杂样品中
IgG N
‑
糖基化定量准确度和检测灵敏度
。
目前开发的方法主要有同位素标记法
(
化学标记
、
酶标记和代谢标记
)
和非标记定量
。
这些定量方法在
IgG N
‑
糖基化定量中各有优缺点
。
近年来，随着质谱技术的发展，
MRM(
多重反应监测技术
)
技术广泛应用于
IgG
糖肽定量，专利号为
CN 109900815A
公开了
MRM
定量分析去糖基化的
IgG
糖肽肽段，由于
MRM
需要通过一一对应的离子对
(
母离子
‑
子离子
)
形式进行糖肽定性定量分析，因此需要寻找准确的母离子
‑
子离子对进行检测，操作复杂且定量准确度较低
。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术提出了一种血清中
IgG
糖肽的
PRM
定量方法及其应用，该方法可以实现血清中
IgG1
‑4四种亚型糖肽的准确定量，且该定量方法检测的动态范围广
、
精度高
、
灵敏度强
、
重复性好
、
抗背景干扰能力强且操作简单，适用范围十分广阔
。
[0005]本专利技术的技术方案是这样实现的：一方面，本专利技术提供了一种血清中
IgG
糖肽的
PRM
定量方法，包括如下步骤：
[0006]S1
，酶解和脱盐：血清样本经胰蛋白酶酶解，
C18
柱脱盐后进行肽段定量得到目标肽段；
[0007]S2
，根据肽段定量结果，用
DDA
采集酶解肽段，利用
GlycanFinder
软件对采集的
DDA
数据进行分析，并根据
IgG1、IgG2、IgG3
和
IgG4
糖肽多肽序列筛选4种
IgG
亚型的目标离子对；
[0008]S3
，对步骤
S2
筛选的离子对进行
PRM
检测，并利用
GlycanFinder
软件对
PRM
数据进行定量分析
。
[0009]在以上技术方案的基础上，优选的，步骤
S2
所述
IgG1
去糖多肽序列为
EEQYDSTYR
，
IgG2
去糖多肽序列为
EEQFDSTFR
，
IgG3
去糖多肽序列为
EQYDSTFR
，
IgG4
去糖多肽序列为
EEQFDSTYR。
[0010]在以上技术方案的基础上，优选的，步骤
S1
中酶解方法为：将血清蛋白加入裂解液中裂解，然后加入三
(2
‑
羧乙基
)
膦，于
30
‑
40℃、1000
‑
2000rpm
条件下震荡反应
0.5
‑
1h
；加入碘乙酰胺，于
20
‑
30℃
条件下避光反应
0.5
‑
1h
；加入胰蛋白酶，于
30
‑
40℃、1000
‑
2000rpm
条件下震荡反应
12
‑
15h
；加入甲酸终止酶解反应
。
[0011]在以上技术方案的基础上，优选的，所述裂解液为尿素和
Tris
‑
HCl
缓冲液
。
[0012]在以上技术方案的基础上，优选的，所述尿素浓度为8‑
10mol/L
，
Tris
浓度为
0.1
‑
0.3mol/L
，三
(2
‑
羧乙基
)
膦浓度为
0.3
‑
0.5mol/L
，碘乙酰胺的浓度为
200
‑
300mmol/L
，胰蛋白酶和血清蛋白的质量比为
1:50
‑
1:30
，甲酸的体积浓度为1％
‑5％
。
[0013]在以上技术方案的基础上，优选的，步骤
S1
中脱盐方法为：将酶解后的血清蛋白肽段于
20
‑
30℃
，
15000
‑
18000g
条件下离心
15
‑
20min
，然后使用
C18
柱脱盐；脱盐抽干本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种血清中
IgG
糖肽的
PRM
定量方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1
，酶解和脱盐：血清样本经胰蛋白酶酶解，
C18
柱脱盐后进行肽段定量得到目标肽段；
S2
，根据肽段定量结果，用
DDA
采集酶解肽段，利用
GlycanFinder
软件对采集的
DDA
数据进行分析，并根据
IgG1、IgG2、IgG3
和
IgG4
糖肽序列筛选4种
IgG
亚型的目标离子；
S3
，对步骤
S2
筛选的离子进行
PRM
检测，并利用
GlycanFinder
软件对
PRM
数据进行定量分析
。2.
如权利要求1所述的一种血清中
IgG
糖肽的
PRM
定量方法，其特征在于：步骤
S2
所述
IgG1
糖肽去糖多肽序列为
EEQYDSTYR
，
IgG2
糖肽去糖多肽序列为
EEQFDSTFR
，
IgG3
糖肽去糖多肽序列为
EQYDSTFR
，
IgG4
糖肽去糖多肽序列为
EEQFDSTYR。3.
如权利要求1所述的一种血清中
IgG
糖肽的
PRM
定量方法，其特征在于：步骤
S1
中酶解方法为：将血清蛋白加入裂解液中裂解，然后加入三
(2
‑
羧乙基
)
膦，于
30
‑
40℃、1000
‑
2000rpm
条件下震荡反应
0.5
‑
1h
；加入碘乙酰胺，于
20
‑
30℃
条件下避光反应
0.5
‑
1h
；加入胰蛋白酶，于
30
‑
40℃、1000
‑
2000rpm
条件下震荡反应
12
‑
15h
；加入甲酸终止酶解反应
。4.
如权利要求3所述的一种血清中
IgG
糖肽的
PRM
定量方法，其特征在于：所述裂解液为尿素和
Tris
‑
HCl
缓冲液
。5.
如权利要求4所述的一种血清中
IgG
糖肽的
PRM
定量方法，其特征在于：所述尿素浓度为8‑
1...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭超，赵锦芝，马俊，程光琴，
申请(专利权)人：百蓁生物技术武汉有限公司，
类型：发明
国别省市：